Özofagus Organoidlerinin Kurulması ve Histolojik Analizi: Normal Dokulardan Kanserli Dokulara İlerlemenin Modellenmesi

Araştırmamız tümör başlangıcı ve erken tümör oluşumuna odaklanmaktadır. Normal hücrelerin tümör hücrelerine nasıl dönüştüğünü ve bu hücrelerin tümör oluşumunu kolaylaştırmak için mikro çevrelerini nasıl değiştirdiğini inceliyoruz. Şu anda, kök hücre teknolojileri, gen düzenleme teknolojileri, gelişmiş 3D kültür sistemi ve biyomalzemeler ve tek hücreli ve mekansal omik teknolojileri dahil olmak üzere araştırmayı teşvik etmek için kullanılan birçok teknoloji bulunmaktadır. Karşılaştığımız en büyük zorluk, organoidleri bakteri ve mantarlardan uzak tutmaktır. Bu kirleticiler, doku işleme ve taşıma sırasında gizlice içeri girer ve genellikle kültürlerimizi mahveder.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, bazal membran matrisini ve insan özofagus organoid kültür ortamını dört santigrat derecede çözün. Doku örneğini beş mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın, ardından örneği oda sıcaklığında yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Steril makas kullanarak, dokuyu 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerinde bir milimetre küp şeklinde parçalar halinde doğrayın. Şimdi, doku parçalarını bir mililitre sindirim tamponunda askıya alın. Dokuyu sindirmek için karışımı 37 santigrat derecede dakikada 50 ila 100 devirde 10 ila 20 dakika çalkalayın. Daha sonra, karışımı 400G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Sonra süpernatanı atın. Peleti 500 mikrolitre% 0.025 Tripsin-EDTA içinde yeniden süspanse edin. Süspansiyonu 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Daha sonra enzimatik aktiviteyi durdurmak için% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş bir mililitre DMEM ekleyin. Daha sonra, süspansiyonu 70 mikrometrelik steril bir filtreden geçirin ve süzüntüyü 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne toplayın. Süzüntüyü dört santigrat derecede 400G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra hücreleri 100 mikrolitre H-EOCM'de yeniden süspanse edin. Hücreleri yeniden askıya aldıktan sonra, bir hücre sayacı kullanarak hücre yoğunluğunu belirleyin. Daha sonra mililitrede 5.000 ila 15.000 hücreyi 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Organoid tohumlama için, 50 ila 100 mikrolitre bazal membran matrisindeki hücreleri nazikçe yeniden süspanse edin. 50 mikrolitre matris hücre karışımını 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunun ortasına pipetleyin. Bodrum membran matrisini polimerize etmek için 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Şimdi matrisi kaplamak için her bir oyuğa 500 mikrolitre ön ısıtma H-EOCM pipetleyin. Daha sonra plakayı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Ortamı değiştirmek için, harcanan ortamı aspire edin. Her bir kuyucuğu önceden 37 santigrat dereceye ısıtılmış 500 mikrolitre taze H-EOCM ile doldurun. Reparafinize edilmiş ve rehidre edilmiş organoidler üzerinde multipleks immünofloresan boyama yapmak. Nem odasına yerleştirilmiş bir slayttaki organoidleri kaplamak için koyun serumu bloke edici solüsyon ekleyin ve slaytı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Slaytı PBS içeren Tween ile iki dakika yıkayın. Daha sonra, organoid alanı kaplamak için seyreltilmiş birincil antikoru bırakın. Antikor gereksinimlerine göre bir nem odasında inkübe edin. İnkübasyondan sonra, slaytları PBS-T'de iki kez iki kez 80 PMM'de termostabil bir odada yıkayın. Şimdi ikincil antikor çözeltisini organoid alana bırakın ve oda sıcaklığında bir nem odasında 20 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, slaytları PBS-T'de iki kez iki kez 80 RPM'de termostabil bir odada yıkayın. Organoid alanı kaplamak ve tekrar inkübe etmek için yıkanmış lam üzerine floresan boya solüsyonu pipetleyin. İnkübasyondan sonra, slaytları PBS-T'de iki kez yıkayın. Çoklu boyama için, antijen alımını ve antikor blokajını tekrarlayın. Sonra organoid alanı kaplamak için dappy solüsyonu bırakın. Fazla lekeyi temizlemek için slaytları iki dakika sterilize edilmiş suya batırın. Dijital görüntüleri elde etmeden önce antifade montaj ortamı ekleyin ve kapak fişi uygulayın. Organoid yapılar, KRT6A boyaması ile görselleştirildiği gibi, normalden karsinom evrelerine giderek daha fazla düzensiz hale geldi. PDL1'in ekspresyonu normal özofagus mukozasından özofagus skuamöz hücreli karsinomuna kadar kademeli olarak artmıştır.