Glikan Analizi için Microglia'dan Mitokondriyal Hazırlık

Genel olarak, araştırmamız şekerlerin veya glikanların mekanik rolünü ve yaşlanmada ve beyin bozukluklarında bu hücresel ve hücre altı glikozilasyon yollarından nasıl yararlanabileceğimizi belirlemeye odaklanmaktadır. Şu anda, inme ve Alzheimer gibi akut ve kronik beyin bozuklukları da dahil olmak üzere farklı hastalık patofizyolojilerinde hücre altı glikanların rolü ve modülasyonu hakkında bilgide bir boşluk vardır. Bu protokol ve araştırmamız, glikanların nöroimmün etkileşimlerdeki rolü ve bu bilgilerin daha iyi ve verimli merkezi sinir sistemi tedavileri tasarlamak için nasıl kullanılabileceği hakkındaki bilgileri geliştirmeyi amaçlamaktadır.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, C57BL / 6 farelerinden türetilen BV-2 mikroglial hücreleri elde edin. Bunları% 10 FBS,% 1 penisilin streptomisin ve% 1 esansiyel olmayan amino asitler ile desteklenmiş DMEM düşük glikoz ortamında tutun. T175 şişelerindeki hücreleri% 70 ila 80 birleşmeye ulaşana kadar büyütün. Medyayı şişeden aspire edin. Hücre peletini bir mililitre büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Tripan mavisi kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 500 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve atın. 800 mikrolitre mitokondriyal izolasyon reaktifi A ekleyin ve beş saniye boyunca orta hızda girdap yapın. Ardından tüpü tam olarak iki dakika buz üzerinde inkübe edin. 10 mikrolitre mitokondriyal izolasyon reaktifi B ekleyin ve beş saniye boyunca maksimum hızda girdap yapın. Beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin, her dakika maksimum hızda girdap yapın. Şimdi 800 mikrolitre mitokondriyal izolasyon reaktifi C ekleyin ve karıştırmak için tüpü ters çevirin. Ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 700 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı iki mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 3.000 G'de santrifüjleyin. Sitozolik kısmı içeren süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Pelet, izole edilmiş mitokondriyi içerir. Pelete 500 mikrolitre mitokondriyal izolasyon reaktifi C ekleyin ve beş dakika boyunca 12.000 G'de santrifüjleyin. İzole edilmiş mitokondriyi 50 mikrolitre protein izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Süspansiyonu 20 dakika buz üzerinde bırakın. Üç kez aspire edin ve dağıtın ve kullanmadan önce girdap yaparak 20 dakika buz üzerinde bırakın. Tamamen çözünmemişse, 50 mikrolitre daha tampon ekleyin ve aynı tüpte toplayın. 13.000 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı geri kazandıktan ve dondurduktan sonra, bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak kurutun. Serbest bırakılan glikanların tespiti için, kurutulmuş ve bağlı glikanları 50 mikrolitre LCMS dereceli su içinde yeniden süspanse edin. Beş mikrolitre yeniden süspanse edilmiş mitokondriyal glikanları bir Teflon mikrokuyu slaytı üzerindeki bir numune noktasına pipetleyin. Dakikada iki mikrolitre akış hızında ve 3,2 kilovoltluk bir voltajda% 60 asetonitril ve bir milimolar asetik asitten oluşan bir elektrosprey çözücü kullanarak negatif iyonizasyon modunda N-glikanları iyonize edin ve tespit edin. Negatif iyonizasyon modunda 502.000 kütle-yük oranını analiz etmek için IR-MALDESI'yi 240.000 tam genişlikte tam genişlikte ve kütle-yük oranı 200'de yarı maksimumda ayarlanmış bir HRAM kütle spektrometresine bağlayın. Monoizotopik kütleleri arayarak N'ye bağlı glikanları manuel olarak tanımlayın. Saniyede minimum 1.000 iyon iyon akısı eşiği ile çift ve üç yüklü iyonları belirlemek için kütle-yük aralığını kullanarak izotopik dağılımları onaylayın. Kütle-yük oranları için ham kütle spektrumlarını nötr monoizotopik kütlelere dönüştürün. Ardından, potansiyel glikan bileşimlerini belirlemek için monoizotopik kütleleri çevrimiçi bir oligosakkarit yapı tahmin aracına yükleyin. Deneysel olarak seçilmiş bir gliko veritabanı kullanarak ek açıklamaları onaylayın. Her tanımlamanın milyonda 2,5 parça kütle ölçüm doğruluğu marjı içinde olduğundan, çekirdek ve bağlı glikan yapısını içerdiğinden ve pentoz, 3-deoksi-d-manno-okt-2-ulosonik asit veya üronik asit monosakkaritlerini hariç tuttuğundan emin olun. Altı bağımsız preparattan elde edilen mitokondriyal protein konsantrasyonları, yüksek tekrarlanabilirliği doğrulayan önemli bir varyasyon göstermedi. Batı kan analizi, CoxIV ekspresyonunu sadece mitokondriyal fraksiyonlarda ve GAPDH'yi sadece sitoplazmik fraksiyonlarda gösterdi, bu da mitokondriyal izolasyonların saflığını ve mitokondriyal olmayan kontaminasyonun olmadığını doğruladı. IR-MALDESI kullanılarak mitokondriyal ekstraktlarda farklı sialile edilmiş, fosforile edilmiş ve sülfatlanmış N-glikan yapıları tespit edildi. Bir uyum iyiliğini test eden yüksek kare değerleri, bir ve iki klor eklentisi ile N-bağlı glikanların tespitini doğruladı ve bu glikan bileşimlerinin IR-MALDESI kullanılarak tespit edildiğini doğruladı.