Hücrelerden Salınan ve Hücrelere Bağlanan İnsan Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü 2'nin Kapsamlı Belirlenmesi için Doğrulanmış İmmünokimyasal Test

İn vitro kültürlenmiş hücreler ve hasta örnekleri için hücreye bağlı ve salınan hücre dışı HER2 proteini alanının hassas bir şekilde ölçülmesini sağlayan yeni monoklonal antikorlar kullanan doğrulanmış bir sandviç olan ELISA'yı sunuyoruz.

Protokol, dolaşımdaki HER2 proteininin konsantrasyonunu teşhis ve araştırmadaki hastalık klinik belirtileri ile ilişkilendirmek için doğru ve doğrulanmış test ihtiyacını ele almaktadır.

Testin geniş çalışma aralığı, numune tiplerinin çeşitliliği ve sonuçların güvenilirliği, in vitro ve in vivo modellerde reseptör durumunun kapsamlı bir analizi için yeni fırsatlar yaratabilir.

Geliştirilen ELISA, kanser dokularından kan, periton sıvıları veya mukus gibi farklı insan vücudu atılımlarına salınan HER2'nin miktar tayini için kullanılacaktır.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, hücreleri% 80 birleşmeye ulaştıktan sonra tripsin kullanarak ayırın ve bunları ayrı bir 15 mililitrelik konik tüpe toplayın. Hücreleri otomatik bir hücre sayacı kullanarak saydıktan ve bir mililitre büyüme ortamı olan 12 oyuklu bir plakada kuyu başına beş hücrenin gücüne 10 kez tohumladıktan sonra. Kültürü% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 santigrat derecede inkübe edin. 24 saatlik kültürden, kültür ortamını her hücre hattının bir oyuğundan 1.5 mililitrelik bir tüpe toplayın. Toplanan numuneleri 10.000 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı eksi 20 santigrat derecede saklamak için yeni bir tüpe aktarın. Her bir kuyucukta kalan hücreleri bir mililitre soğuk PBS ile yıkayın, nazikçe aspire edin ve PBS'yi atın. Ardından, her bir oyuğa %1 proteaz inhibitörü ile desteklenmiş 200 mikrolitre RIPA tamponu ekleyin ve beş dakika inkübe edin. Şimdi, hücreleri bir hücre kazıyıcı ile kazıyın ve homojenize etmek için birkaç kez pipetleyerek lizatı karıştırın. Parçalanmış hücreleri yeni bir tüpe toplayın ve numuneyi yavaşça 0,8 x 40 milimetre ölçülerinde 21 gauge iğne ile donatılmış iki mililitrelik bir şırıngaya aspire edin. Beş ila 10 kez aspire ettikten sonra, toplanan numuneleri 10.000 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı eksi 20 santigrat derecede saklamak için yeni bir tüpe aktarın. Anti-HER2 yakalama antikorunu kodlama tamponunda mililitrede bir mikrograma seyreltin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 96 oyuklu bir ELISA plakasının her bir oyuğuna 100 mikrolitre yakalama antikor çözeltisi ekleyin. Plakayı sızdırmazlık filmi ile örtün. Plakayı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Gece boyunca inkübasyondan sonra, plakayı oda sıcaklığında bir saat boyunca yatay bir mikro plaka çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Bir mikroplaka yıkayıcı kullanarak, kaplama solüsyonunu aspire edin ve her bir kuyuyu 300 mikrolitre PBST ile üç kez yıkayın. Daha sonra, çok kanallı bir pipetle, spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için kaplanmış her bir oyuğa PBS'de %5 yağsız kuru süt içeren 100 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin. Şimdi kalibrasyon eğrisini ve pozitif kontrolü hazırlayın. Mililitre başına bir miligramlık iki mikrolitre, HER2 stok çözeltisi 1.998 mikrolitre PBS'ye eklenerek mililitre başına 1000 nanogram çalışma standardı oluşturun. Standart iki için, 500 mikrolitre standart bir ila 500 mikrolitre PBS ekleyin ve mililitre konsantrasyon başına 50 nanogram elde etmek için iyice karıştırın. Üç ila yedi arasında standartlar oluşturmak için seri seyreltme hazırlayın. Daha sonra, PBS hücre lizatları ve bilinen HER2 konsantrasyonları ile çivilenmiş kültür ortamı kullanarak matris numuneleri hazırlayın. Tespit sınırının altında HER2 seviyeleri elde etmek için hücre lizatlarını 2.5 mikrolitre lizat ve beş mililitre PBS ile bir ila 2000 seyreltin. Mililitre başına iki nanogramlık bir çözelti hazırlamak için, sekiz mikrolitre standart bir ila 392 mikrolitre PBS kültür ortamı veya hücre lizatı ekleyin ve iyice karıştırın. Tek kanallı bir pipet kullanarak, 100 mikrolitre standart PBS boş ekleyin ve test numunelerinin her biri üç nüsha halinde, kaplanmış ve bloke edilmiş ELISA plakasının ilgili kuyucuklarına ekleyin. Nem odasında 37 santigrat derecede bir saat sonra, plakayı bir mikroplaka yıkayıcı kullanarak yıkayın. Antikor bağlanmasını tespit etmek için, PBS'deki biyotinile tespit edici antikoru mililitre başına bir mikrogramlık bir çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Daha sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak, her bir oyuğa bu tespit edici antikor çözeltisinden 100 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, AVID ve HRP konjugatını 40 mililitre PBST'de bir ila 40.000 arasında seyreltin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, her bir oyuğa 100 mikrolitre seyreltilmiş konjugat ekleyin. Plakayı inkübe ettikten ve yıkadıktan sonra, renk metrik reaksiyonunu başlatmak için her bir oyuğa 100 mikrolitre 3,3 5,5 tetrametilbenzidin substrat eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Ardından, plakayı bir sızdırmazlık filmi ile kaplayın. Plakayı 37 santigrat derecede bir ila beş dakika inkübe edin ve renk gelişimini izlerken ışıktan koruyun. İstenilen renk yoğunluğuna ulaşıldığında, reaksiyonu sonlandırmak için her oyuğa 100 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin. Son olarak, bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı 450 nanometrede ölçün. Dört parametreli bir kalibrasyon eğrisi kullanarak, eğri denklemine dayalı olarak numune konsantrasyonunu hesaplayın. Geliştirilen sandviç ELISA, HER2 proteini için mililitre başına 1.56 ila 100 nanogram arasında bir çalışma aralığı gösterdi ve mükemmel eşleşmeyi gösteren bir belirleme katsayısı gösterdi. Kültür ortamındaki HER2 konsantrasyonu, 72 saatte en yüksek değerlere sahip test edilen tüm hücre hatları için zamanla artmıştır. SK-OV-3 ve SK-BR-3 hücreleri, 24 saat sonra kültür ortamındaki MDA-MB-231 hücrelerine kıyasla sırasıyla yaklaşık on kat ve 50 kat daha yüksek HER2 konsantrasyonları gösterdi. Benzer şekilde, lizatlardaki HER2 seviyeleri SK-OV-3 ve SK-BR-3 için sırasıyla yaklaşık üç kat ve beş kat daha yüksekti. İlginç bir şekilde, hücre kültürü ortamı, tüm hücre lizatlarında bulunan zara bağlı proteine kıyasla test edilen antijenin 1000 kat daha düşük konsantrasyonlarını içeriyordu.