Mycobacterium Türlerinin DNA Mikroarray Çip Yöntemi ile Tanımlanması

[Anlatıcı] Bu araştırma, klinik mikrobiyolojide moleküler tanıya odaklanmaktadır. Geleneksel tespit yöntemleriyle karşılaştırıldığında, mikobakteri türlerini tanımlamaya yönelik DNA mikrodizi çip yöntemi oldukça hassas, spesifik ve hızlıdır ve bu da klinik hastaların erken teşhisi için önemli yardım sağlayabilir. Şu anda, tüberküloz dışı mikobakteriler için hızlı tanımlama yöntemleri, hastanın klinik tanı ve tedavisini doğrudan etkileyen birçok taban laboratuvarında sınırlıdır. Başlamak için, sabit sıcaklıktaki su banyosunun sıcaklığını 50 santigrat dereceye ayarlayın ve önceden ısıtın. Çip hazırlamak için, gen mikrodizi çip hibridizasyon kutusunun dibine 200 mikrolitre damıtılmış su ekleyin. Köşeli ayracı kutunun içindeki iki konumlandırma sütunu arasına yerleştirin. Çipi, ön tarafı yukarı bakacak şekilde dikkatlice braketin üzerine yerleştirin ve dört çıkıntı aşağı bakacak şekilde lamel ile örtün, lamel ucunun çipin ucundaki etiketle hizalandığından emin olun. Daha sonra numune sayısına göre 200 mikrolitrelik santrifüj tüpleri veya sekiz kuyucuklu şerit hazırlayın ve bunları uygun şekilde etiketleyin. Kitteki hibridizasyon tamponunu tamamen eriyene kadar 50 santigrat derecede ısıtın. İyice karıştırdıktan sonra, bir mikro santrifüjde hızlı bir şekilde santrifüjleyin. Hazırlanan her tüp veya şeride dokuz mikrolitre hibridizasyon tamponu ayırın. Her tüpe karşılık gelen PCR ürününden altı mikrolitre ekleyin ve reaksiyon karışımı başına 15 mikrolitrelik bir nihai hacim elde edin. Hibridizasyon reaksiyonu karışımını, bir PCR cihazı veya su banyosu kullanarak denatüre etmek için beş dakika boyunca 95 santigrat dereceye ısıtın. Denatürasyon işleminden sonra, karışımı hemen bir buzlu su karışımına daldırın ve üç dakika inkübe edin. Hibridizasyon reaksiyonu karışımını buz banyosundan çıkarın ve iki kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Beyaz topaklaştırıcı çökelti kalmadığında, lamellerin yükleme deliğinden 13,5 mikrolitre reaksiyon karışımı ekleyin. Hibridizasyon kutusunu hızla kapatıp kapatın ve çip numarasını, mikrodizi konumunu ve numune numarasını kaydedin. Şimdi, kapalı hibridizasyon kutularını önceden 50 santigrat dereceye ısıtılmış sabit sıcaklıktaki su banyosuna yatay olarak yerleştirin. Tüm kutuları içine yerleştirdikten sonra zamanlayıcıyı 120 dakika boyunca başlatın. Hibridizasyon reaksiyonu tamamlandıktan sonra hibridizasyon kutularını yatay olarak çıkarın, sökün ve talaşları alın. Cipsleri hemen oda sıcaklığına dengelenmiş Talaş Yıkama Solüsyonu I ile doldurulmuş bir kabın içindeki slayt rafına yerleştirin ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca sabit sıcaklıktaki bir çalkalayıcıda 80 ila 100 RPM'de yıkayın. Cipsleri, oda sıcaklığında üç dakika boyunca 80 ila 100 RPM'ye ayarlanmış çalkalayıcıda Talaş Yıkama Solüsyonu II ile tekrar yıkayın. Şimdi cipsleri bir santrifüje koyun ve oda sıcaklığında 100 g'da beş dakika döndürün. Tarayıcıyı açın. Ve sonra ilgili yazılımı açın. 10 dakika boyunca ön ısıtmaya izin vermek için Lazer Kontrolü düğmesine tıklayın. Örnekle ilgili bilgileri yazılıma girin. Tarayıcı ön ısıtmayı bitirdikten sonra, Çıkar düğmesine tıklayın. Kurutulmuş çipi küçük braket parçasının üzerine sabit bir şekilde yerleştirin. Çipi yavaşça ve yatay olarak tarayıcı bölmesine itin ve Yükle düğmesine tıklayın. Şimdi, çip numarasını yazılıma girin ve 1'den 4'e kadar algılama alanı mikrodizisini seçmek için tıklayın. Her mikrodizi için karşılık gelen örnekleri seçmek için Örnek Seç'e tıklayın. Ardından çip taramasını başlatmak için Algılamayı Başlat'a tıklayın. Tarama sonuçları ekranda görüntülenecek ve otomatik olarak kaydedilecektir. Veri sorguları ve yazdırma işlemleri gerçekleştirmek için veri sorgu sayfasını kullanın. Tüm işlemleri tamamladıktan sonra lazeri kapatın, yazılımdan çıkın ve son olarak tarayıcıyı kapatın. Deneysel sonuçların geçerliliği, pozitif kontrolün mycobacterium tuberculosis kompleksinin tespit sonucunu vermesi ve negatif kontrolün mikobakteri vermemesi ile kalite kontrol ile doğrulanır. Test numunelerinin yorumlanması, en yüksek sinyal değerine sahip olan da dahil olmak üzere tüm probların negatif olduğu ve mikobakteri bulunmadığına dair bir raporla sonuçlandığı durumlarla başlar. Yalnızca mycobacterium tuberculosis kompleks probunun güçlü bir sinyal gösterdiği örneklerde, sonuç o tür grubu için pozitif olarak tanımlanır. Mycobacterium avium'a karşılık gelen prob güçlü bir sinyale sahip tek prob ise, numune mycobacterium avium için pozitif olarak tanımlanır. Yalnızca iç kontrol probu pozitif ve diğerlerinin tümü negatifse, sonuç belirsiz olarak rapor edilir ve bu da tespit kitinin kapsamadığı bir mikobakteri türünün varlığını gösterir.