Akut Miyeloid Lösemi Hasta Kaynaklı Ksenotransplantların Hücre İçi Fosfoflow Sitometrisi

Araştırmamız, akut miyeloid löseminin onaylanmış tedavilere nasıl direnç geliştirdiğini anlamayı amaçlamaktadır. Metabolik önemli bir rol oynadığı hipotezine dayanmaktadır. Nihai hedef, bu direncin etkili bir şekilde üstesinden gelebilecek stratejiyi belirlemektir. Lösemi araştırmalarında yaygın olarak kullanılan akış sitometrisi, lösemik hücreler gibi süspansiyon hücrelerini analiz etmek için idealdir. Uyarlanabilirliği onu veri moleküler mekanizması için güçlü bir araç haline getirir. AML araştırmalarındaki ana deneysel zorluk, terapötik direncin altında yatan mekanizmayı anlayarak, doğru modelleme için hücre olan moleküler canlandırma için optimal bir in vivo protokol geliştirmektir.

[Anlatıcı] Başlamak için, farenin dizini bükün ve delinme tarafının bulunduğu femurun eklem yüzeyini ortaya çıkarmak için baskın olmayan eli kullanarak bacağını hareketsiz hale getirin. Başparmağınızı kaval kemiğine, işaret parmağınızı uyluk kemiğine ve orta parmağınızı kemiklerin dış tarafına yerleştirerek stabilize edin. İmmobilizasyonu sürdürürken, kalan tüyleri bir kenara çekmek ve kemik yapısının görselleştirilmesini geliştirmek için diz bölgesini izopropil alkolle dezenfekte edin. İlk kuru 25 gauge şırıngayı kullanarak, iğneyi femur ekleminin ortasına yerleştirin ve femur eklem yüzeyinde kuvvet uygulamadan bir delik oluşturmak için hafifçe döndürün. İğne iliğe girdiğinde, şırıngayı döndürürken yavaş yavaş geri çekin. İkinci yıkanmış şırıngayı birinci iğne tarafından oluşturulan deliğe yerleştirin. Femura yerleştirilen ikinci şırıngaya vakum uygulayın, hafifçe döndürün ve yavaş yavaş geri çekin. Şırınga içeriğini 500 mikrolitre PBS içeren soğutulmuş bir mikro santrifüj tüpüne yıkayarak çıkarılan kemik iliğini aktarın. Numuneyi buz üzerinde tutun. Herhangi bir kanamayı durdurmak için izopropanol bir bez kullanarak delinme bölgesine 30 saniye boyunca hafif bir baskı uygulayın. Hücreleri 500G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Bir vakum aspirasyon sistemi kullanarak, süpernatanı nazikçe aspire edin ve atın. Floresan hücre boyama solüsyonu numunesi başına 200 mikrolitre ekleyin. Ölü hücreleri etiketlemek için PBS'de birden 100'e kadar seyreltildi. Hücreleri bir pipetle yavaşça yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri ışıktan koruyarak buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. 10 dakika sonra, hücreleri 500G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir vakum sistemi kullanarak aspire edin ve atın, insan hematopoietik hücrelerini etiketlemek için %2 fetal sığır serumu içeren PBS'de bir ila 100'e seyreltilmiş HCD 45 Brilliant ultraviyole 395 antikor numunesi başına 100 mikrolitre ekleyin. Hücreleri buz üzerinde 15 dakika inkübe edin ve ışıktan korunmalarını sağlayın. Hücreleri 500G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Bir vakum sistemi kullanarak süpernatanı aspire edin ve atın. Peleti PBS çözeltisinde bir mililitre %1.6 formaldehit içinde yeniden süspanse edin. Işıktan koruyarak oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 10 dakika sonra, hücreleri 500G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Bir vakum sistemi kullanarak süpernatanı aspire edin ve atın. Şimdi eksi 20 santigrat derecede önceden soğutulmuş bir mililitre %100 metanolü doğrudan ikisine ekleyin. Numuneleri eksi 20 santigrat derecede ışıktan koruyarak 30 dakika inkübe edin. Hücreleri 500G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Bir vakum sistemi kullanarak süpernatanı aspire edin ve atın. Her numuneye 50 mikrolitre antikor karışık solüsyonu veya izotip kontrol karışık solüsyonu ekleyin. Hücreleri bir pipet kullanarak yavaşça yeniden süspanse edin, tüm numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin ve ışıktan korunmalarını sağlayın. Daha sonra hücreleri 500G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri bir pipetle hafifçe yeniden süspanse ederek 1000 mikrolitre PBS ile yıkayın. Hücreleri tekrar 500G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, 1000 mikrolitre PBS kullanarak ikinci bir yıkama yapın ve hücreleri tekrar dört santigrat derecede santrifüjlemeden önce hücreleri bir pipetle hafifçe yeniden süspanse edin. Süpernatantı aspire ettikten sonra, son numuneleri 200 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Bu şekil, 15 gün boyunca venetoklaks bazlı tedavi ile tedavi edilen akut miyeloid lösemi hastasından türetilen ksenograft farelerden alınan kemik iliği hücrelerindeki iş akışını, geçit stratejisini ve hücre içi fosfoprotein sinyallerinin normalleşmesini göstermektedir. Geçit stratejisi, ileri ve yan dağılım profillerine ve CD45 pozitifliğine dayalı olarak canlı insan akut miyeloid lösemi veya AML hücrelerini başarıyla tanımlayarak tüm tedavi gruplarında tutarlı analizlere olanak sağladı. Venetoklaks 5-azasitidin ve CDZ üridin tedavisi, AML hücrelerinde STAT5 ve RPS6'nın fosforilasyonunun artmasına yol açtı ve bu da dirençle ilişkili hayatta kalma yollarının aktivasyonunu düşündürdü. İlginç bir şekilde, fareler Gilteritinib ile tedavi edildiğinde, tedavi, hedefe yönelik tedaviye rağmen sinyalleşmenin devam ettiğini gösteren FLT3 yolu proteinlerinin fosforilasyonunu önemli ölçüde azaltmadı. Fosforile STAT5 ve fosforile RPS6, venetoklaks bazlı tedaviden sonra ekspresyon seviyelerinde korelasyonda en güçlü artışı gösterdi ve bu yolların birlikte aktivasyonunu gösterdi.