Name: Akut Miyeloid Lösemi Hasta Kaynaklı Ksenotransplantların Hücre İçi Fosfoflow Sitometrisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Keşfedin akut miyeloid lösemi hücrelerinde fosfoflow sitometri yöntemiyle mTORC1, JAK/STAT5 ve MAPK sinyal yollarını fare ksenotransplant modelinde analiz etmeyi. Bu yöntem hedefe yönelik kanser tedavileri için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Ferrara, F., Schiffer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukaemia+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukaemia in adults.</a> Lancet. 381 (9865), 484-495 (2013).</li>
<li>Döhner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+AML+in+adults%3A+2017+ELN+recommendations+from+an+international+expert+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel.</a> Blood. 129 (4), 424-447 (2017).</li>
<li>Chung, Y. R., Kim, E., Abdel-Wahab, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femoral+bone+marrow+aspiration+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Femoral bone marrow aspiration in live mice.</a> J Vis Exp. (89), e51660(2014).</li>
<li>Haas, A., Weckbecker, G., Welzenbach, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Phospho-Flow+cytometry+reveals+novel+insights+into+TCR+proximal+signaling+events.+A+comparison+with+Western+blot%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Intracellular Phospho-Flow cytometry reveals novel insights into TCR proximal signaling events. A comparison with Western blot.</a> Cytometry A. 73 (9), 799-807 (2008).</li>
<li>Perbellini, O., Cavallini, C., Chignola, R., Galasso, M., Scupoli, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-specific+flow+cytometry+reveals+signaling+heterogeneity+in+t-cell+acute+lymphoblastic+leukemia+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Phospho-specific flow cytometry reveals signaling heterogeneity in t-cell acute lymphoblastic leukemia cell lines.</a> Cells. 11 (13), 2072(2022).</li>
<li>Kornblau, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+activation+of+multiple+signal+transduction+pathways+confers+poor+prognosis+in+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Simultaneous activation of multiple signal transduction pathways confers poor prognosis in acute myelogenous leukemia.</a> Blood. 108 (7), 2358-2365 (2006).</li>
<li>Perl, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+targeted+therapy+in+the+management+of+patients+with+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am+Soc+Hematol+Educ+Program%22%5BJournal%5D)">The role of targeted therapy in the management of patients with AML.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2017 (1), 54µ65(2017).</li>
<li>Márton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+phosphorylation+of+signaling+proteins+in+the+prognosis+of+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Oncol+Res%22%5BJournal%5D)">The roles of phosphorylation of signaling proteins in the prognosis of acute myeloid leukemia.</a> Pathol Oncol Res. 30, 1611747(2024).</li>
<li>Levis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLT3+mutations+in+acute+myeloid+leukemia%3A+what+is+the+best+approach+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am+Soc+Hematol+Educ+Program%22%5BJournal%5D)">FLT3 mutations in acute myeloid leukemia: what is the best approach in 2013.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 220-226 (2013).</li>
<li>Roux, P. P., Topisirovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+involved+in+the+regulation+of+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways involved in the regulation of mRNA translation.</a> Mol Cell Biol. 38 (12), e00070-e00118 (2018).</li>
<li>Nepstad, I., Hatfield, K. J., Grønningsæter, I. S., Reikvam, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PI3K-Akt-mTOR+signaling+pathway+in+human+Acute+Myeloid+Leukemia+%28AML%29+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The PI3K-Akt-mTOR signaling pathway in human Acute Myeloid Leukemia (AML) Cells.</a> Int J Mol Sci. 21 (8), ijms21082907(2020).</li>
<li>Jia, X., Zhou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-eIF4E%3A+A+new+target+for+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protein+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Phospho-eIF4E: A new target for acute myeloid leukemia.</a> Curr Protein Pept Sci. 22 (4), 328-335 (2021).</li>
<li>Ghosh, J., Kapur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mTORC1-S6K1+signaling+pathway+in+regulation+of+hematopoietic+stem+cell+and+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Role of mTORC1-S6K1 signaling pathway in regulation of hematopoietic stem cell and acute myeloid leukemia.</a> Exp Hematol. 50, 13-21 (2017).</li>
<li>Park, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+resistance+in+acute+myeloid+leukemia+cells+is+mediated+by+a+novel+ATM%2FmTOR+pathway+regulating+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Therapeutic resistance in acute myeloid leukemia cells is mediated by a novel ATM/mTOR pathway regulating oxidative phosphorylation.</a> Elife. 11, 79940(2022).</li>
<li>Oki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+mTORC1+pathway+activity+in+vivo+reveals+marked+shifts+that+support+time-specific+inhibitor+therapy+in+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic mTORC1 pathway activity in vivo reveals marked shifts that support time-specific inhibitor therapy in AML.</a> Nat Commun. 12 (1), 245(2021).</li>
<li>Lee, H. J., Daver, N., Kantarjian, H. M., Verstovsek, S., Ravandi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+JAK+pathway+dysregulation+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The role of JAK pathway dysregulation in the pathogenesis and treatment of acute myeloid leukemia.</a> Clin Cancer Res. 19 (2), 327-335 (2013).</li>
<li>Liu, A. C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+STAT5+signaling+overcomes+resistance+to+IDH+Inhibitors+in+acute+myeloid+leukemia+through+suppression+of+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting STAT5 signaling overcomes resistance to IDH Inhibitors in acute myeloid leukemia through suppression of stemness.</a> Cancer Res. 82 (23), 4325-4339 (2022).</li>
<li>Sung, P. J., Sugita, M., Koblish, H., Perl, A. E., Carroll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cytokines+mediate+resistance+to+targeted+therapy+in+FLT3-ITD+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cytokines mediate resistance to targeted therapy in FLT3-ITD acute myeloid leukemia.</a> Blood Adv. 3 (7), 1061-1072 (2019).</li>
<li>Song, P., Yang, F., Jin, H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+protein+translation+and+its+implications+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">The regulation of protein translation and its implications for cancer.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 68(2021).</li>
<li>This Standard Operating Procedure (SOP) describes methods for anesthetizing mice. , McGill University. 
 <a target="_blank" href="https://www.mcgill.ca/research/files/research/110-mouse_anesthesia-2024-06-17.pdf">https://www.mcgill.ca/research/files/research/110-mouse_anesthesia-2024-06-17.pdf</a> (2024).</li>
<li>Tech Team Tips: Preparing a Sample with AO/PI. , DeNovix. 
 <a target="_blank" href="https://www.denovix.com/webinars/tech-team-tips-preparing-a-sample-with-ao-pi">https://www.denovix.com/webinars/tech-team-tips-preparing-a-sample-with-ao-pi</a> (2021).</li>
<li>Suni, M. A., Maino, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+cell+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of cell signaling proteins.</a> Methods Mol Biol. 717, 155-169 (2011).</li>
<li>Krutzik, P. O., Irish, J. M., Nolan, G. P., Perez, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+phosphorylation+and+cellular+signaling+events+by+flow+cytometry%3A+techniques+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein phosphorylation and cellular signaling events by flow cytometry: techniques and clinical applications.</a> Clin Immunol. 110 (3), 206-221 (2004).</li>
<li>Chen, W., Luu, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+by+multiparameter+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping by multiparameter flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1633, 51-73 (2017).</li>
<li>Perez, O. D., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-proteomic+immune+analysis+by+flow+cytometry%3A+From+mechanism+to+translational+medicine+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Phospho-proteomic immune analysis by flow cytometry: From mechanism to translational medicine at the single-cell level.</a> Immunol Rev. 210, 208-228 (2006).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 mL şırıngalar 25G x 5/8 TW&nbsp;</td><td>BD Biyolojik Bilimler</td><td>#309626</td><td>Kemik iliği aspirasyonu için şırıngalar</td></tr><tr><td>1.7 mL Mikrosantrifüj Tüpleri</td><td>Kurbağa Biyo</td><td>#LMCT1,7 milyar</td><td>Kemik iliği aspirasyonu ile geri kazanılan hücreleri alikot etmek</td></tr><tr><td>BD Horizon Brilliant Leke Tamponu</td><td>BD Biyolojik Bilimler</td><td>#563794</td><td>Boyama işlemleri için</td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>Fidelis Hayvan Sağlığı</td><td>Ethiqa XR</td><td>Fareler için analjezi</td></tr><tr><td>CellDrop FL Sınırsız</td><td>Kurbağa Biyo</td><td>#CellDrop FL- UNLTD</td><td>Hücre sayısı için</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Wisent Inc.</td><td>#311-425-CL</td><td>Kemik iliği aspirasyonu ile geri kazanılan hücreler için ortam</td></tr><tr><td>Eppendorf Santrifüj 5427 R</td><td>Millipore Sigma</td><td>#EP5429000260</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu Isı İnaktive Premium CA</td><td>Wisent Inc.</td><td>#090-450</td><td>Boyama işlemleri için</td></tr><tr><td>Formaldehit çözeltisi</td><td>Millipore Sigma</td><td>#F1635</td><td>Hücre Geçirgenliği</td></tr><tr><td>humanCD45 [HI30] antikor&nbsp;</td><td>BD Biyolojik Bilimler</td><td>#563792</td><td>BUV395 ile birleştirilmiş antikor</td></tr><tr><td>ID7000 Spektral Hücre Analizörü</td><td>Sony</td><td></td><td>Spektral akış sitometre analizörü</td></tr><tr><td>İzofluran %99,9 sıvı</td><td>McKesson'ın</td><td>#803250</td><td>Fareler için anestezi</td></tr><tr><td>İzospire (izofluran) İnhalasyon Anestezisi</td><td>Dechra Hakkında</td><td></td><td>Fareler için anestezi</td></tr><tr><td>Canlı/ölü AO/PI</td><td>Kurbağa Biyo</td><td>CD-AO/PI-1.5</td><td>Hücre sayısı için</td></tr><tr><td>Canlı/ölü Zombi NIR</td><td>BioLegend+B6:C12</td><td>#423106</td><td>Spektral akış sitometrisi için</td></tr><tr><td>Metanol çözeltisi</td><td>Millipore Sigma</td><td>#179957</td><td>Hücre Fiksasyonu</td></tr><tr><td>P-4EBP1 (Thr37/46) [236B4] antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>#2846</td><td>Alexa Fluor 488 ile birleştirilmiş antikor</td></tr><tr><td>p-Erk1/2 (Thr202/Tyr204) [197G2] antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>#13148</td><td>Alexa Fluor 647 ile birleştirilmiş antikor</td></tr><tr><td>p-RPS6 (Ser240/244) [D68F8] antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>#9468</td><td>Alexa Fluor 594 ile birleştirilmiş antikor</td></tr><tr><td>p-STAT5 (Tyr694) [D47E7] antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>#14603</td><td>PE ile birleştirilmiş antikor</td></tr><tr><td>Tavşan IgG Kontrolü [DA1E]</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>#2975</td><td>Alexa Fluor 488 ile birleştirilmiş antikor</td></tr><tr><td>Tavşan IgG Kontrolü [DA1E]</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>#2985</td><td>Alexa Fluor 647 ile birleştirilmiş antikor</td></tr><tr><td>Tavşan IgG Kontrolü [DA1E]</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>#8760</td><td>Alexa Fluor 594 ile birleştirilmiş antikor</td></tr><tr><td>Tavşan IgG Kontrolü [DA1E]</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>#5742S</td><td>PE ile birleştirilmiş antikor</td></tr><tr><td>Dezenfektan mendiller</td><td>Birleşik Kanada</td><td>#UCDWPR-9022</td><td>Kemik iliği aspirasyonu için dezenfeksiyon</td></tr></tbody></table>

akut miyeloid lösemi hasta kaynaklı ksenotransplantların hücre İçi fosfoflow sitometrisi

Intracellular Phosphoflow Cytometry of Acute Myeloid Leukemia Patient-Derived Xenotransplants

Deneysel tasarım, seçilen proteinlerin fosforilasyon durumunu farklı zaman noktalarında, örneğin 1 günlük tedavi öncesi başlatma ve 15 günlük tedavi sonrası başlatma gibi izlemeyi amaçlamaktadır. Bu taban çizgisi, tedaviden sonra sinyal yolu aktivasyonundaki sonraki değişikliklerin doğruluğunu doğrulamak için kritik bir kontrol görevi görür. On beş günlük tedaviden sonra, tedavi edilen farelerde araç ile tedavi edilen kontrollere karşı yol modülasyonunu değerlendirmek için ikinci bir karşılaştırma yapılır (Şekil 4). Bu iki aşamalı yaklaşım, tedaviye bağlı etkilerin başlangıç değişkenliğinden ayırt edilmesine izin verir.
Bu çalışma için bir AML PDX fare modeli kullanılmıştır. Farelere, aşağıdaki mutasyonlarla karakterize edilen hasta kaynaklı AML hücreleri nakledildi: DNMT3AMR882H H'lik bir varyant alel fraksiyonu (VAF), NPM1W288fs VAF 6, FLT3ITD VAF ve IDH2R140Q VAF D. Transplantasyondan sonra, tedaviye başlamadan önce tümör büyümesi için üç hafta izin verildi. FLT3 mutant nakledilen PDX fareleri on beş gün boyunca üç rejimden biriyle tedavi edildi: plasebo, gilteritinib (günde 15 mg / kg) veya venetoklaks (günde 50 mg / kg), 5-azasitidin (günde 2.5 mg / kg) ve sedarizudin (günde 3 mg / kg) kombinasyonu (Şekil 4A).
Elde edilen sonuçlarla ilgili olarak, venetoklaks bazlı bir rejimle tedavinin önemli ölçüde artmış STAT5 ve RPS6 fosforilasyonu ile sonuçlandığını belirtmek dikkat çekicidir, bu da bu yolların tedavi direncine katkıda bulunduğunu düşündürmektedir (Şekil 4E). Buna karşılık, FLT3'ü hedefleyen bir ilaç olan gilteritinib, mutant FLT3 efektörlerinin fosforilasyon durumunu azaltmadı. Test edilen AML örneğinde, FLT3-ITD (örneğin, IDH2) dışındaki ek ikincil mutasyonların varlığının bu yolların aktivasyonuna katkıda bulunması veya iki hafta boyunca ilaç tedavisinin, azalmış sinyalleme ile AML hücrelerinin seçici olarak elimine edilmesiyle sonuçlanması mümkündür. Analiz edilen tüm fosfoproteinler aynı hücre popülasyonundan kapılı olduğundan, fosfoprotein aktivasyonunu karşılaştırmak mümkündür. Bu deneyde, fosfoprotein boyamasındaki en güçlü korelasyon, her ikisi de tedaviden sonra bu deney grubunda yukarı regüle edilen p-STAT5 ve p-RPS6 (Ek Şekil 1A) arasında görünmektedir (Şekil 4E). p-STAT5 ve p-ERK arasında daha az bir ilişki var gibi görünmektedir (Ek Şekil 1B). Daha da önemlisi, hücre boyutu (FSC-A kullanılarak değerlendirilen) genel p-STAT5 pozitifliğine önemli bir katkıda bulunmaz, bu da boyama pozitifliğinin sadece hücre boyutunun bir ürünü olmadığını vurgular (Ek Şekil 1C). Bu deneysel çerçeve, bu tedavilerin sinyal yolu modülasyonu üzerindeki etkilerinin kapsamlı bir değerlendirmesini sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig01.jpg"> 
Şekil 1: Hedef sinyal yollarının görselleştirilmesi ve bunların analizi için strateji. (A) p-STAT5 (Tyr694), p-4EBP1 (Thr37/46), p-RPS6 (Ser240/244) ve p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) içeren sinyal yollarına genel bakış. P-STAT5 yolunda, JAK otofosforilasyona uğrar, katalitik aktivitesini arttırır, daha sonra spesifik tirozin kalıntılarını fosforile ederek STAT proteinleri için kenetlenme bölgeleri oluşturur. Fosforile STAT5 (Tyr694) homojenize olur ve çekirdeğe yer değiştirir, burada hedef genlerin promotör bölgelerindeki spesifik STAT'a duyarlı elementlere bağlanır. RAS-RAF-MEK-ERK kaskadında, ligand bağlanması üzerine FLT3 reseptörünün veya diğer reseptör tirozin kinazların (RTK'ler) otofosforilasyonu, RAS üzerinde GTP için GSYİH'nın değişimine yol açar ve böylece RAS'ı aktive eder. Aktive edilmiş RAS-GTP, RAF'ı plazma zarına alır, burada RAF konformasyonel bir değişikliğe uğrar ve aktif hale gelir. RAF daha sonra çift özgüllüklü bir kinaz olan MEK1/2'yi fosforile eder ve aktive eder, bu da ERK'yi Thr202/Tyr204 kalıntılarında fosforile eder. Aktive edilmiş ERK1/2, spesifik transkripsiyon faktörlerini fosforile ettiği çekirdeğe yer değiştirir. ERK1/2 ayrıca, ara sinyal yolları aracılığıyla, mTORC1 aktivitesini artırabilir ve translasyon aktivitesini artırmak için belirli bölgelerde eIF4E'yi fosforile edebilir. FLT3 ve diğer RTK'lar aracılığıyla besinler ve büyüme faktörleri tarafından aktive edilen mTORC1, S6K1 ve 4E-BP1 gibi aşağı akış hedeflerini fosforile eder. S6K1, sırayla, ribozom fonksiyonunu artıran ve translasyonu aktive eden RPS6'yı fosforile eder. 4E-BP1'in hiperfosforilasyonu, eIF4E'yi serbest bırakır ve çeviri başlatma kompleksi eIF4F'nin montajına ve kapağa bağlı çevirinin aktivasyonuna izin verir. Bu yolların tümü AML'de yüksek oranda yer alır ve hücre proliferasyonunu, metabolizmasını ve apoptotik sinyallere direnci artırarak edinilmiş adaptasyonlara katkıda bulunur. (B) kemik iliği aspirasyonu ve hücre içi fosfoflow boyama birleştirilmiş protokolünün ana adımlarını sunar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig02.jpg"> 
Şekil 2: Kemik iliği aspirasyon prosedürü sırasında kritik adımların görselleştirilmesi. Cerrahi alan ve gerekli malzemeler laminer akış başlığı altına yerleştirilir. İzofluran inhalasyonu (A) ile anestezi yapıldıktan sonra, femoral eklem yüzeyi aspirasyon için hazırlanır (B,C). Femur kemiği, femur kemiğinin (D) ortasına hizalanmış bir ilk şırınga ile delinir. İğneye güçlü basınç uygulamaktan kaçınmak ve bunun yerine döner bir delme hareketi gerçekleştirmek çok önemlidir; Bu genellikle iğnenin kemiğin yüzeyini delmesi ve femur boşluğunun yolunu takip etmesi için yeterlidir. Daha sonra, kemik iliği delinme bölgesinden (I, J) ikinci bir şırınga ile aspire edilir. Kemik iliği aspiratı bir mikrosantrifüj tüpüne (K) aktardıktan sonra, bölgedeki (L) kanamayı durdurmak için hafif bir basınç uygulanır ve fare iyileşme için ılık ve temiz bir kafese yerleştirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig03.jpg"> 
Şekil 3: İzotip kontrolleri de dahil olmak üzere geçit stratejisi analizi için iş akışı. (A), canlı hücreler için geçit stratejilerini, çiftlerin dışlanmasını ve hCD45 pozitif AML hücrelerini temsil eder. (B) her bir fosfoprotein için sinyalleri kahverengi ve izotip kontrollerini siyah renkte (iki biyolojik kopya) gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig04.jpg"> 
Şekil 4: Canlı kemik iliği AML hücrelerinin immüno-belirtilmesinden sonra hücre içi fosfoproteinlerin tespiti ve analizi için iş akışı. (A) Hasta tarafından bağışlanan AML hücreleri ile aşılanmış NSG-SGM3 fareleri, araç (kontrol) veya venetoklaks, 5-azasitidin ve sedazuridin (vene / aza / CDZ) veya gilteritinib ile tedavi edildi. 15 gün sonra Kemik İliği (BM) aspiratları işlendi. (B), tedaviden 15 gün sonra canlı AML hücrelerinin (örneğin, hCD45 / Zombi-NIR pozitif) analizi için geçit stratejisini temsil eder. (C, D), venetoklaks / 5-azasitidin / sedazuridin veya araç (B) veya gilteritinib veya araç (C) ile tedavi edilen farelerden izole edilen 10.000 AML hücresinde, belirtildiği gibi fosfoantikorların her biri için sinyalin normalizasyonunu temsil eder. İzler, araç (açık mavi), vene/aza/CDZ (kırmızı) veya gilteritinib (mor) ile tedavi edilen kontrol faresinden izole edilen AML hücrelerindeki sinyalleri temsil eder. (E) Histogram, üç fareden ve SD'den canlı insan AML CD45 + hücreleri üzerinde test edilen her bir fosfoprotein için boyama yoğunluklarındaki ortalama değer değişikliklerini temsil eder. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Yıldız işaretleri, 0.05 (*) ve 0.01 (**) altındaki p değerleri ile ANOVA tarafından değerlendirilen boyama yoğunluklarında önemli farklılıklar olduğunu göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antikor</td>
			<td>Florokrom</td>
			<td>Seyreltme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-RPS6 (Ser240/244)</td>
			<td>AF594 Serisi</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-4EBP1 (Thr37/46)</td>
			<td>AF488 Serisi</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-STAT5 (Tyr694)</td>
			<td>PE</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)</td>
			<td>AF647 Serisi</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavşan IgG kontrolü</td>
			<td>AF594 Serisi</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavşan IgG kontrolü</td>
			<td>AF488 Serisi</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavşan IgG kontrolü</td>
			<td>PE</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavşan IgG kontrolü</td>
			<td>AF647 Serisi</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Antikorlar için optimize edilmiş seyreltmelerin listesi.
Ek Şekil 1: Temsili bir AML PDX numunesinde p-STAT5, p-RPS6, p-ERK1/2 ve FSC-A'nın karşılaştırılması. Bu şekil, venetoklaks / 5-azasitidin / sedazuridin ile tedavinin 15. gününde fare "E9" da p-STAT5, p-ERK ve p-RPS6 arasındaki ilişkinin bir örneğini göstermektedir ( Şekil 4C'den elde edilen sonuç). Bu örnekte, fosfoprotein boyamasındaki en güçlü korelasyon, her ikisi de tedaviden sonra bu deney grubunda yukarı regüle edilen p-STAT5 ve p-RPS6 (A) arasında görünmektedir (Şekil 4E). p-STAT5 ve p-ERK (B) arasında daha az bir ilişki var gibi görünmektedir. Daha da önemlisi, hücre boyutu (FSC-A kullanılarak değerlendirilir) genel p-STAT5 pozitifliğine önemli bir katkıda bulunmaz, bu da boyama pozitifliğinin sadece hücre boyutunun (C) bir ürünü olmadığını vurgular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/Figure%20S1%20jove.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Akut Miyeloid Lösemi Hasta Kaynaklı Ksenotransplantların Hücre İçi Fosfoflow Sitometrisi

To adapt and resist approved treatments, acute myeloid leukemia (AML) cells activate specific molecular pathways that lead to changes in gene expression, ...

Araştırmamız, akut miyeloid löseminin onaylanmış tedavilere nasıl direnç geliştirdiğini anlamayı amaçlamaktadır. Metabolik önemli bir rol oynadığı hipotezine dayanmaktadır. Nihai hedef, bu direncin etkili bir şekilde üstesinden gelebilecek stratejiyi belirlemektir. Lösemi araştırmalarında yaygın olarak kullanılan akış sitometrisi, lösemik hücreler gibi süspansiyon hücrelerini analiz etmek için idealdir. Uyarlanabilirliği onu veri moleküler mekanizması için güçlü bir araç haline getirir. AML araştırmalarındaki ana deneysel zorluk, terapötik direncin altında yatan mekanizmayı anlayarak, doğru modelleme için hücre olan moleküler canlandırma için optimal bir in vivo protokol geliştirmektir.[Anlatıcı] Başlamak için, farenin dizini bükün ve delinme tarafının bulunduğu femurun eklem yüzeyini ortaya çıkarmak için baskın olmayan eli kullanarak bacağını hareketsiz hale getirin. Başparmağınızı kaval kemiğine, işaret parmağınızı uyluk kemiğine ve orta parmağınızı kemiklerin dış tarafına yerleştirerek stabilize edin. İmmobilizasyonu sürdürürken, kalan tüyleri bir kenara çekmek ve kemik yapısının görselleştirilmesini geliştirmek için diz bölgesini izopropil alkolle dezenfekte edin. İlk kuru 25 gauge şırıngayı kullanarak, iğneyi femur ekleminin ortasına yerleştirin ve femur eklem yüzeyinde kuvvet uygulamadan bir delik oluşturmak için hafifçe döndürün. İğne iliğe girdiğinde, şırıngayı döndürürken yavaş yavaş geri çekin. İkinci yıkanmış şırıngayı birinci iğne tarafından oluşturulan deliğe yerleştirin. Femura yerleştirilen ikinci şırıngaya vakum uygulayın, hafifçe döndürün ve yavaş yavaş geri çekin. Şırınga içeriğini 500 mikrolitre PBS içeren soğutulmuş bir mikro santrifüj tüpüne yıkayarak çıkarılan kemik iliğini aktarın. Numuneyi buz üzerinde tutun. Herhangi bir kanamayı durdurmak için izopropanol bir bez kullanarak delinme bölgesine 30 saniye boyunca hafif bir baskı uygulayın. Hücreleri 500G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Bir vakum aspirasyon sistemi kullanarak, süpernatanı nazikçe aspire edin ve atın. Floresan hücre boyama solüsyonu numunesi başına 200 mikrolitre ekleyin. Ölü hücreleri etiketlemek için PBS'de birden 100'e kadar seyreltildi. Hücreleri bir pipetle yavaşça yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri ışıktan koruyarak buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. 10 dakika sonra, hücreleri 500G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir vakum sistemi kullanarak aspire edin ve atın, insan hematopoietik hücrelerini etiketlemek için %2 fetal sığır serumu içeren PBS'de bir ila 100'e seyreltilmiş HCD 45 Brilliant ultraviyole 395 antikor numunesi başına 100 mikrolitre ekleyin. Hücreleri buz üzerinde 15 dakika inkübe edin ve ışıktan korunmalarını sağlayın. Hücreleri 500G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Bir vakum sistemi kullanarak süpernatanı aspire edin ve atın. Peleti PBS çözeltisinde bir mililitre %1.6 formaldehit içinde yeniden süspanse edin. Işıktan koruyarak oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 10 dakika sonra, hücreleri 500G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Bir vakum sistemi kullanarak süpernatanı aspire edin ve atın. Şimdi eksi 20 santigrat derecede önceden soğutulmuş bir mililitre %100 metanolü doğrudan ikisine ekleyin. Numuneleri eksi 20 santigrat derecede ışıktan koruyarak 30 dakika inkübe edin. Hücreleri 500G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Bir vakum sistemi kullanarak süpernatanı aspire edin ve atın. Her numuneye 50 mikrolitre antikor karışık solüsyonu veya izotip kontrol karışık solüsyonu ekleyin. Hücreleri bir pipet kullanarak yavaşça yeniden süspanse edin, tüm numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin ve ışıktan korunmalarını sağlayın. Daha sonra hücreleri 500G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri bir pipetle hafifçe yeniden süspanse ederek 1000 mikrolitre PBS ile yıkayın. Hücreleri tekrar 500G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, 1000 mikrolitre PBS kullanarak ikinci bir yıkama yapın ve hücreleri tekrar dört santigrat derecede santrifüjlemeden önce hücreleri bir pipetle hafifçe yeniden süspanse edin. Süpernatantı aspire ettikten sonra, son numuneleri 200 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Bu şekil, 15 gün boyunca venetoklaks bazlı tedavi ile tedavi edilen akut miyeloid lösemi hastasından türetilen ksenograft farelerden alınan kemik iliği hücrelerindeki iş akışını, geçit stratejisini ve hücre içi fosfoprotein sinyallerinin normalleşmesini göstermektedir. Geçit stratejisi, ileri ve yan dağılım profillerine ve CD45 pozitifliğine dayalı olarak canlı insan akut miyeloid lösemi veya AML hücrelerini başarıyla tanımlayarak tüm tedavi gruplarında tutarlı analizlere olanak sağladı. Venetoklaks 5-azasitidin ve CDZ üridin tedavisi, AML hücrelerinde STAT5 ve RPS6'nın fosforilasyonunun artmasına yol açtı ve bu da dirençle ilişkili hayatta kalma yollarının aktivasyonunu düşündürdü. İlginç bir şekilde, fareler Gilteritinib ile tedavi edildiğinde, tedavi, hedefe yönelik tedaviye rağmen sinyalleşmenin devam ettiğini gösteren FLT3 yolu proteinlerinin fosforilasyonunu önemli ölçüde azaltmadı. Fosforile STAT5 ve fosforile RPS6, venetoklaks bazlı tedaviden sonra ekspresyon seviyelerinde korelasyonda en güçlü artışı gösterdi ve bu yolların birlikte aktivasyonunu gösterdi.

intracellular-phosphoflow-cytometry-acute-myeloid-leukemia-patient

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, lösemi hücrelerinde proteinlerin stromal sitokin kaynaklı hücre içi fosforilasyonunun değerlendirmesini göstermektedir. Bu hücre içi fosforile proteinler, fosfo-akış sitometrisi tekniği kullanılarak ölçülür.

Stromal Sitokin ile İndüklenen Hücre İçi Protein Fosforilasyonunun Fosfo-Flow Sitometri Kullanılarak Değerlendirilmesi

Biz aynı anda ifade birincil akut myeloid lösemi hücreleri üzerinde lösemi kök hücre işaretlerinin Akış Sitometresi tarafından tespit etmek için bir protokol anahat. Biz üç yaratıcı nüfus ve artan olgunlaşma derecesi ile sözde bir LSC nüfus ölçmek için nasıl gösterir. Biz bu nüfus içinde karşılık gelen hasta-türetilen-xenografts varlığını doğruladı.

Akış Sitometresi lösemi kök hücre birincil Akut Miyeloid Lösemi ve hasta-türetilen-xenografts, tanı ve takip yukarı tahmin etmek için

Fare orthotopic PDAC homografts immunophenotyping deneysel ameliyat tümör IMMUNO-microenvironment profil oluşturma amaçlamaktadır. Tümör ameliyat ile implante orthotopically vardır. Tümör boyutu 200-600 mm3 hasat ve tek hücreli süspansiyonlar, çok bağışıklık marker FACS analizi farklı fluorescently etiketli antikorlar tarafından takip hazırlamak için ayrışmış.

Orthotopic Homogref (Syngeneic) fare birincil KPC pankreas duktal adenokarsinom, akış sitometresi tarafından Immunophenotyping

Biz murine sağlıklı hematopoetik kök ve döl hücreleri (HSPCs) ve akut miyeloid lösemi bir fare modeli lösemi hücreleri (ROS) tarafından tahrik mitokondriyal reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için multiparametre akış sitometri sitometri kullanmak için bir yöntem tanımlamak MLL-AF9.

Murine Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücrelerde Mitokondriyal Reaktif Oksijen Türlerinin Akış Sitometrik Analizi ve MLL-AF9 Tahrikli Lösemi

İnsan primer akut miyeloid lösemi (AML) örneklerinde NKG2D ligand (NKG2DL) tespiti için iki farklı boyama protokolü sunuyoruz. İlk yaklaşım, bilinen ve potansiyel olarak henüz bilinmeyen tüm ligandları tanıyabilen bir füzyon proteinine dayanırken, ikinci protokol birden fazla anti-NKG2DL antikorunun eklenmesine dayanır.

Akut Miyeloid Lösemide Kök Hücreleri Toplu AltÜlmelerden Ayırt Etmek İçin NKG2D Ligand Yüzey Tespitinin İki Akış Sitometrik Yaklaşımı

Burada, akut lenfoblastik lösemi hastası kaynaklı ksenogreft modelinin, CD19 hedefli kimerik antijen reseptörü T hücresi ile ilişkili toksisiteleri değerlendirmek ve izlemek için bir strateji olarak kullanıldığı bir protokol tanımlanmıştır.

Akut Lenfoblastik Lösemi Hasta Kaynaklı Ksenogreft Fare Modeli Kullanılarak Kimerik Antijen Reseptörü T Hücresi İlişkili Toksisitelerin Değerlendirilmesi

Zebra balığı T-akut lenfoblastik lösemi modelindeki hareketsiz hücreleri tanımlamak için hücre proliferasyon boyaması kullandık. Leke, bölünmeyen hücrelerde tutulur ve hücre proliferasyonu sırasında azaltılır, bu da daha fazla sorgulama için hareketsiz hücrelerin seçilmesini sağlar. Bu protokol, hücresel sessizlik bağlamında kendini yenilemeyi incelemek için işlevsel bir araç sağlar.

Zebra Balığı T Hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi Modelinde Hareketsiz Hücrelerin Hücre Proliferasyonu Boyama Kullanılarak Tanımlanması 

Bu protokol, geçici olarak bağışıklığı baskılanmış zebra balığı embriyolarında hücre hatlarından ve taze hasta materyalinden insan akut lenfoblastik lösemi (ALL) ksenogreftlerinin oluşturulması ve sorun giderilmesi için adım adım talimatların yanı sıra akış sitometrisi kullanılarak ilaç yanıtı değerlendirmesi için kılavuzlar sağlar. Deneysel boru hattı katı tümörler için de uyarlanabilir.

Zebra Balığı Embriyolarında Lösemi Hücre Greftleri Kullanılarak Hızlı İn Vivo İlaç Yanıtı Tahmini

Bu protokol, enjeksiyondan 4 gün sonra meydana gelen, hasta kaynaklı B ve T akut lenfoblastik lösemi (ALL) hücrelerinin in ovo ksenogreftlemesini tanımlar.

Burada: Ovo Hasta Kaynaklı Akut Lenfoblastik Lösemi (ALL) Hücrelerinin Ksenogreftlenmesi (PDX-ALL)

Bu video fare kemik iliği myeloid dendritik hücrelerin ayırt etmek için prosedür göstermektedir. İzolasyon fare tibia ve femur, ve kemik iliği işleme göstermiştir. Hücre fenotipi ve CpG IL-12 üretimi takiben olgunlaşma gösteren farklılaşma öncesi ve sonrası hücre morfolojisi gösteren resimler ve rakamlar gösterilmektedir.

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Keşfedin akut miyeloid lösemi hücrelerinde fosfoflow sitometri yöntemiyle mTORC1, JAK/STAT5 ve MAPK sinyal yollarını fare ksenotransplant modelinde analiz etmeyi. Bu yöntem hedefe yönelik kanser tedavileri için kritik öneme sahiptir.

Akut Miyeloid Lösemi Hasta Kaynaklı Ksenotransplantların Hücre İçi Fosfoflow Sitometrisi

Daha fazla video keşfet