Prostat Kanseri ile İlişkili Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

Kanserle İlişkili Fibroblast'ın prostat kanserinde tümör ilerlemesine katkıda bulunduğu mekanizmayı anlamayı ve bu karışmayı terapötik bir strateji olarak nötralize etmeyi amaçlıyoruz. Farklı özelliklere sahip farklı CAF popülasyonları, çeşitli manipülasyonlar üzerine tümör ve stromal hücreler kullanılarak elde edilen 3D organoidlerde değerlendirilebilir. Protokolümüz, bu amaçlar için güvenilir bir şekilde CAF'ler oluşturmaya izin verir.

Başlıca zorluklar, tümör ve normal hücrelerin aynı hastaların mikro ortamlarından güvenilir bir şekilde izole edilmesi, heterojenlik, spesifik CAF belirteçlerinin yokluğu, CAF'lerin plastisitesi ve TME karmaşıklığını özetleyen sınırlı in vitro modellerdir. Benzer yöntemlerle, transkripsiyon faktörü STAT3'ün ve hedef genlerinin murin meme kanseri CAF'lerinde temel pro-tümör rolünü karakterize ettik ve terapötik hedefler olarak etkinliklerini gösterdik. Prostat kanseri hastalarından az miktarda doku kullanılarak elde edilen radikal prostatektomi örneklerinin tümörden ve komşu normal bölgelerinden fibroblastların optimal izolasyonu.

Başlamak için, fibroblast izolasyonu için doku örneklerini ilk gün terazide tartın. Steril forseps kullanarak dokuyu altı santimetrelik kaplara aktarın. Mendili dört mililitre buz gibi soğuk PBS'de iki kez ve dört mililitre buz gibi soğuk tam DMEM'de iki kez yıkayın.

Şimdi dokuyu buz üzerinde altı santimetrelik bir plakaya aktarın. Tabağa bir mililitre antibiyotik takviyeli DMEM ekleyin. Ardından dokuyu bir milimetre kareden daha küçük parçalara ayırmak için makas veya bıçak kullanın.

Kıyılmış dokuyu beş mililitre buz gibi soğuk tam DMEM içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Ardından süspansiyonu 754 g'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. 10 mililitrelik bir pipet kullanarak süpernatanı çıkarın.

Peleti beş mililitre buz gibi soğuk tam DMEM'de yeniden süspanse edin ve tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, peleti kollajenaz II çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Süspansiyonu 1,5 mililitrelik mikrotüplere aktarın.

Mikrotüpleri parafin film ile kapatın. Ardından, sekiz ila 12 saat boyunca sürekli sallayarak gece boyunca sindirim için 37 santigrat dereceye yerleştirin. Ertesi gün sindirilmiş numuneleri 15 mililitrelik konik tüplere aktarın.

Kollajenazı etkisiz hale getirmek için beş mililitre buz gibi soğuk tam DMEM'i pipetleyin. Ardından süspansiyonu 754 g'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı pipetledikten sonra peleti bir mililitre %0.05 tripsin-EDTA içinde yeniden süspanse edin.

Ara sıra çalkalayarak 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Ardından, numunelere bir mililitre taze hazırlanmış DNase I solüsyonunu pipetleyin ve iyice karıştırın. Süpernatanı santrifüjledikten ve çıkardıktan sonra, peleti beş mililitre soğuk tam DMEM içinde yeniden süspanse edin ve tekrar santrifüjleyin.

Elde edilen hücreleri, %20 fetal sığır serumu ile desteklenmiş tam DMEM'de yeniden süspanse edin. Hücreleri plakalayın ve en az üç gün boyunca %5 karbondioksit ve %95 nem ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Üç gün sonra hücreleri morfoloji ve canlılık açısından inceleyin.

Hücreler birleşmeye ulaştığında, onları %20 fetal sığır serumu içeren tam DMEM içeren 10 santimetrelik bir kaba geçirin. Plaka kanseri ile ilişkili fibroblastlar veya normal fibroblastlar, 12 kuyucuklu plakalarda %70 birleşimde. Ertesi gün, steril koşullar altında 50 mililitrelik konik bir tüpte 12.5 mililitre PBS'ye 0.45 gram düşük erime noktalı agar ekleyin.

Karışımı bir mikrodalga fırın kullanarak çözün. Agar çözeltisini 37 santigrat dereceye kadar soğutun. Daha sonra çalışan bir çözelti hazırlamak için önceden ısıtılmış tam DMEM ile bir ila dört oranında seyreltin.

Ortamı 12 oyuklu plakadan aspire edin. Her bir oyuğa 500 mikrolitre çalışan agar çözeltisi pipetleyin. Agar katılaşmasına izin vermek için dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.

Bu arada kalan agar solüsyonunu 37 santigrat derecede tutun. Tümör hücrelerini tripsinize edin ve mililitrede 20.000 hücrelik bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Her koşul için üç teknik kopyayı hesaba katan yedi mililitrelik bir nihai hacim elde etmek için eşit hacimlerde tümör hücresi süspansiyonunu ve agar çözeltisini karıştırın.

Eşit karıştırmayı sağlamak için birden çok kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, her bir oyuktaki katılaşmış taban tabakasının üzerine yaklaşık 5.000 hücre içeren bu karışımdan 500 mikrolitre dağıtın. Agarın dört santigrat derecede 20 dakika katılaşmasına izin verdikten sonra, her kuyucuğa bir mililitre tam DMEM ekleyin.

Kuyunun kenarından hafifçe aspire ederek ve ortasına taze ortam ekleyerek ortamı gün aşırı değiştirin. Koloniler kolayca görünür hale gelene kadar inkübe edin. Koloniler görünür hale geldiğinde, kültür ortamını atın.

Daha sonra kolonileri 200 mikrolitre Nitro mavisi tetrazolyum klorür çözeltisi ile boyayın. Nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün boyama solüsyonunu atın.

Stereo mikroskop kullanarak lekeli kolonilerin görüntülerini elde edin. Saf fibroblastlar başarıyla izole edildi. Çoğu durumda, özellikle erken geçişlerde, kanserle ilişkili fibroblastlar, normal fibroblastlara kıyasla daha iğ benzeri bir morfoloji sergiledi.

Kantitatif analiz, kanserle ilişkili fibroblast şartlandırılmış ortamla tedavi edilen DU145 hücrelerinin proliferasyonunun, normal fibroblast koşullandırılmış ortamla tedavi edilen veya tedavi edilmeden bırakılanlara göre 120 saat boyunca önemli ölçüde daha yüksek olduğunu doğruladı. Doğrudan kanserle ilişkili fibroblastlar ve normal fibroblastlarla birlikte kültürlenen DU145 hücreleri de kontrollere göre 96 saat boyunca artan proliferasyon gösterdi. Karşılık gelen büyüme eğrileri, kanserle ilişkili ve normal fibroblastlarla birlikte kültürün, zaman içinde DU145 proliferasyonunda benzer bir artışa yol açtığını gösterdi.

Şartlandırılmış ortamın DU145 proliferasyonu üzerindeki etkisi, kanserle ilişkili fibroblast ve normal fibroblast çiftleri arasında değişiklik gösterdi ve erken geçiş çiftleri, sonrakilerden önemli ölçüde daha güçlü etkiler gösterdi. Yumuşak agar koloni oluşumu deneylerinde, hem kanserle ilişkili hem de normal fibroblastlar, kontrollere kıyasla DU145 kolonilerinin sayısını ve boyutunu arttırdı, bu da ankrajdan bağımsız büyümenin arttığını gösterdi. Teknik sorunlar nedeniyle oluşan kopmuş fibroblast tabakaları bazı replikalarda koloni oluşumunu engellemiştir.

Tek başına şartlandırılmış ortam, DU145 hücrelerinde ankrajdan bağımsız koloni oluşumunu desteklemedi.