Yüksek Verimli İskele Tabanlı Kültür Platformu Olarak SPOT'un Tekrarlanabilir Üretimi

Araştırmamız, ilaç tarama tahlili iş akışını iyileştirmek ve gelişmiş hastalık modellemesine yardımcı olmak için sağlam, tekrarlanabilir, hastadan türetilmiş orgonomik kültürler için yüksek verimli, iskele destekli platformlar geliştirmeye odaklanmaktadır.

Otomatik sıvı işleyiciler, iskele destekli hidrojel platformları, çip üzerinde organ teknolojileri ve akış sitometrisi ve SITOP'lar gibi tek hücreli analizler mevcut teknolojilerden bazılarıdır.

Mevcut zorluklar arasında hidrojel bütünlüğünün korunması, gerçek zamanlı görüntüleme için jel menisküsün üstesinden gelinmesi ve uzun vadeli organoid bazlı analizlerde tek tip hücre dağılımının sağlanması yer almaktadır.

Protokolümüz tutarlı, iskele destekli hidrojel yüklemesi sağlar, menisküs sorunlarını en aza indirir, uzun vadeli organoid kültürünü destekler ve otomatik sıvı işleyiciler ve yüksek içerikli görüntüleme sistemi ile sorunsuz bir şekilde entegre olur.

Kanserde hastalık ilerleme mekanizmalarını ve obezitenin gelişimini keşfetmek için hastalık modelleme platformlarımızı kullanmaktan büyük heyecan duyuyoruz.

[Eğitmen] Başlamak için 96 veya 384 SPOT için bir PMMA model iskelesi alın. İskelenin mavi bölgesinin etrafındaki fazla kağıdı, çevresinde beş milimetrelik beyaz bir kenar boşluğu bırakarak kesin. Ortaya çıkan tabakanın yaklaşık 760 milimetre x 1.300 milimetre ölçülerinde olduğundan emin olun. 96 SPOT'luk bir iskeleyi montaja hazırlamak için sert bir akrilik desteğin üzerine bir parça polietilen film döşeyin. Bu film kaplı desteği çalışma yüzeyine yerleştirin ve iskeleyi polietilen filmin üzerine yerleştirin. Kuyulara girmekten kaçınmak için cetvelin kenarını iskelenin ilk iki sırası arasına hizalayın. İzleme tekerleğini iskelenin altına yerleştirin ve cetvel tarafından yönlendirilerek yukarı doğru yuvarlayın. 384 SPOT iskele için perforasyon yapmayın. Daha sonra iskeleyi, pürüzlü tarafı yukarı bakacak şekilde bir PDMS levhası üzerine yerleştirin ve sıraların yatay olarak ilerlemesini sağlayın. Hangi tarafın pürüzlü olduğunu belirlemek için astar hattını kullanın, ardından kırışıklıkları veya kabarcıkları gidermek için iskeleyi levhanın üzerine düzeltin. Çift taraflı bandın kazınmamış tarafındaki koruyucu tabakayı çıkarın. Bandı ortasından hafifçe bükün ve bandın ortadaki iki sütununu iskele ile hizalayın. Şimdi hizalamayı sağlamak için bandın ortasını iskeleye bastırın. Eşit şekilde yapıştırmak için bandı merkezden dışa doğru düzleştirin. Cımbız kullanarak iskeleyi PDMS levhasından yavaşça kaldırın. Levhayı ileride kullanmak üzere saklayın. İskeleyi ikinci kuyu bandına takmak için, iskeleyi pürüzsüz, bantlanmamış tarafı tezgahın üzerine bakacak şekilde çevirin. İki merkezi sütunu ortaya çıkarmak için ikinci bandın oyulmuş tarafındaki orta koruyucu tabakayı çıkarın. İkinci bandın ortasını hafifçe bükün ve iskelenin orta sütunlarına hizalayın, ardından yerine sabitlemek için bant merkezine bastırın. Kazınmış bant kullanılıyorsa, açıkta kalan merkeze bitişik kalan koruyucu katmanları çıkarın. Bandı ortadan başlayıp dışa doğru hareket ettirerek düzeltin. İskeleyi dipsiz plakaya tutturmak için koruyucu tabakayı çıkarın. İskeleyi dipsiz plakanın altına bir kapakla hizalayın. Hizalandıktan sonra ortasını plakanın üzerine bastırın. Kazınmış bant kullanıyorsanız, bitişik katmanları çıkarın ve iskeleyi merkezden dışarıya doğru plaka üzerine düzeltin. İskeleyi polikarbonat filme tutturmak için cımbız kullanarak polikarbonat filmin bir tarafındaki koruyucu tabakayı dikkatlice gevşetin, ardından filmde herhangi bir girintiye neden olmadan koruyucu tabakayı yavaşça soyun. İşlemi ikinci taraf için tekrarlayın, ardından filmi tezgahın üzerine koyun. Plakanın tabanındaki koruyucu bant tabakasını soyun ve polikarbonat filmi merkezden dışarıya doğru iskele üzerine bastırın. Daha sonra her kuyucuğun tanımlanmış bir sınıra sahip olduğundan emin olmak için polikarbonat filmi iskelenin üzerine sıkıca bastırın. Hassas bir bıçak kullanarak plakanın altındaki fazla malzemeyi dikkatlice kesin. Tam montajdan sonra, 96 SPOT plakasını şeffaf, yeniden kapatılabilir bir plastik torbaya koyun ve biyogüvenlik kabininin dışına çıkarın. Plakanın altına sert bir akrilik destek yerleştirin ve her ikisini de zıt köşelerden sıkıştırın. Plakayı daha fazla kullanana kadar temiz ve kuru bir yerde saklayın. 384 SPOT plakasındaki alternatif kuyucuklar 30 günlük bir test süresi boyunca floresein ve PBS ile doldurulduğunda herhangi bir ortam sızıntısı veya değişimi gözlenmedi, bu da PMMA bariyerinin kuyudan kuyuya izolasyonu korumadaki etkinliğini doğruladı. 96 SPOT plakasına ekilen GFP eksprese eden pankreas tümörü organoidleri canlı kaldı ve kültürün sıfır gününden 12. gününe kadar aşamalı olarak genişledi. 12. günde, SPOT ile yetiştirilen organoidler, iç lümen yapılarının varlığı ile birlikte güçlü sitokeratin 19 ve Zonula Occludens-1 ekspresyonu sergiledi. 384 SPOT plakasında optimal olmayan ve optimal doku tohumlama sonuçları, kenar tanımı ve hücre dağılımı tekdüzeliği ile görsel olarak ayırt edilebilirdi. Otomatik sıvı işleyici kullanılarak 96 SPOT ve 384 SPOT plakasının tamamında tutarlı bir şekilde tek tip tohumlama elde edildi.