Rose Bengal ile Fotodinamik Terapinin İn Vitro Uygulanması için Yenilikçi LED Tabanlı Aydınlatma Cihazının Geliştirilmesi

Araştırmamızın kapsamı, etkili tedavi seçenekleri olmayan kanser tedavisinde fotodinamik tedavinin etkisini karakterize etmeyi amaçlayan temel ve translasyonel projeler geliştirmektir. Mevcut deneysel zorluklar, yeni ışığa duyarlılaştırıcılar ve yeni aydınlatma cihazları da dahil olmak üzere, in vitro olarak klinik uygulamaya kadar fotodinamik tedavinin uygulanması için gerekli teknolojileri geliştirmektir. Diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, protokolümüz, 96 oyuklu bir plakanın ve bir hücre kültürü inkübatörü içindeki fizyolojik durumun daha cömert bir şekilde aydınlatılmasını sağlayan düşük maliyetli ve ev yapımı bir cihaz içerir.

Başlamak için, kültürlenmiş HepG2 hücrelerini inkübatörden çıkarın ve şişeyi önceden temizlenmiş mikrobiyolojik güvenlik istasyonunun altına yerleştirin. Bir pipet kullanarak kültür ortamını kültür şişesinden çıkarın. Artık ortamı ortadan kaldırmak için, hafifçe karıştırırken fosfat tamponlu solüsyonla durulayın, ardından tamponu dikkatlice çıkarın.

Daha sonra, hücrelere %0.25 tripsin ve 0.53 milimolar EDTA içeren üç mililitre tripsin çözeltisi uygulayın ve hücreleri ayırmak için kültürü beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübatöre geri koyun. Beş dakika sonra, tripsini nötralize etmek ve hücreleri askıya almak için şişeye yedi mililitre kültür ortamı ekleyin. Şimdi tripsin, ortam ve ayrılmış hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Hücreleri saymak için, 20 mikrolitre hücre solüsyonunu temiz bir tüpe pipetleyin ve 20 mikrolitre tripan mavisi solüsyonu ekleyin. Karıştırdıktan sonra lekeli karışımı sayma slaytına yükleyin ve hücre sayacına yerleştirin. Daha sonra, bir tüpe kültür ortamı ekleyin, ardından mililitrede 150.000 hücrelik nihai bir konsantrasyona ulaşmak için hücreleri tanıtın.

Kuyu başına dört hücrenin gücüne 1,5 çarpı 10 oranında berrak, düz tabanlı beyaz 96 oyuklu bir plakaya tohumlayın. Her canlılık okuma süresi için iki plaka hazırlayın. Hücrelerin tutunmasını sağlamak için tedaviden önce plakaları 24 saat inkübe edin.

Bir gül bengal stok çözeltisi hazırlamak için,% 10 tuzlu su çözeltisinde çözün. Gül bengal arıtma solüsyonlarını hücre kültürü ortamında sıfır ila 100 mikromolar arasında değişen konsantrasyonlarda seyreltin. Şimdi, kültür ortamını hücre plakalarından çıkarın ve her bir kuyucuğa 100 mikrolitre hazırlanmış gül bengal arıtma solüsyonu ekleyin.

İçselleştirmeye izin vermek için hücreleri iki saat boyunca gül bengal ile inkübe edin. İki saat sonra, gül bengal çözeltisini her bir kuyucuktan çıkarın, hücreleri iki kez PBS ile yıkayın, PBS'yi aspire edin ve gül bengal serbest kültür ortamının kuyucuğu başına 100 mikrolitre ekleyin. Mikroplakaları ışıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün ve fotodinamik terapi testi sırasında plakaların yarısını aydınlatma için ayırın.

Işık dağıtıcısındaki erkek konnektörü ışık kaynağının dişi konnektörüne bağlayın. Fotodinamik terapiyi ve karanlık durum mikroplakalarını inkübatörden çıkarın. Fotodinamik terapi plakasını açın.

Ardından, 96 kuyu boyunca santimetre kare başına ortalama 0,62 miliwatt ışınım sağlamak için LED sürücüsündeki dimmer'ı maksimum seviyeye ayarlayın. Bundan sonra, plakayı ışık dağıtıcısına yerleştirin. Hücreler üzerinde istenen ışık dozu elde edilene kadar mikroplakayı aydınlatın.

İstenilen ışık dozuna ulaşıldığında cihazı kapatın. Fotodinamik terapi mikroplakasını alüminyum folyoya yeniden sarın ve canlılık testi yapılana kadar kontrol plakasıyla birlikte inkübatöre geri koyun. Fotodinamik terapi testini tamamladıktan sonra, tedavi sonrası hücresel tepkiye izin vermek için ışıklı plakayı 24 saat boyunca inkübatöre yerleştirin.

İnkübasyon süresinden sonra, bir ışıklı ve bir ışıksız plaka alın. Mitokondriyal metabolizmayı ve ATP üretimini ölçmek için her bir kuyucuğa hücre canlılığı test kitinden 100 mikrolitre reaktif ekleyin. Lüminesans ölçümüne geçmeden önce plakaları karanlıkta 10 dakika inkübe edin.

10 dakika sonra, multimodal bir okuyucu kullanarak her bir kuyucuktaki lüminesansı okuyun. İşlenmemiş kontrol kuyularından gelen lüminesansın %100 canlılığı temsil ettiğini düşünün. Her bir arıtma koşulu için canlılık yüzdesini hesaplamak için arıtılmış kuyulardan bu kontrole lüminesans değerlerini normalleştirin.

24 saat, 48 saat ve 72 saat gibi tedavi sonrası ek zaman noktalarında hücre canlılığı ölçümü için aynı protokolü tekrarlayın. Gül bengali olmadan tek başına aydınlatma, test edilen ışık dozlarının hiçbirinde HepG2 hücre canlılığını değiştirmedi ve ışıksız tek başına gül bengali de tüm konsantrasyonlarda önemli bir değişikliğe neden olmadı. CELL-LED-550/3 kullanılarak yapılan gül bengal aracılı fotodinamik tedavi, tüm ışık dozlarında HepG2 hücre canlılığını önemli ölçüde azaltarak güçlü bir sitotoksik etki gösterdi.

LED emisyon profili ile gül bengal'in absorpsiyon spektrumu arasındaki örtüşme, CELL-LED-550/3 cihazının ışığa duyarlılaştırıcı ile spektral uyumluluğunu doğruladı. Gelecekte, ana hedeflerimizden biri, her biri hem spesifik kanser hücresi hedeflemesini sağlayan ışığa duyarlı bileşik hem de ilgili bir aydınlatma cihazı içeren yeni PDT paketleri geliştirmektir.