Name: Tip I ve Tip II FLT3 İnhibitörlerine Maruz Kaldıktan Sonra FLT3 Mutant Eksprese Eden 32D Hücrelerde DNA Hasarını Ölçmek için Kuyruklu Yıldız Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Öğrenin, kuyruklu yıldız testiyle FLT3 mutant 32D hücrelerinde tip I ve tip II FLT3 inhibitörlerinin genotoksik etkilerini değerlendirin. AC220'nin Gilteritinib'den daha fazla DNA hasarına neden olduğunu keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. FLT3-ITD mutasyonlarına sahip 32D hücrelerde bir DNA hasar modelinin oluşturulması 18
<ol>
	<li>Hücre kurtarma<ol>
		<li>Forseps kullanarak, dondurularak saklanan FLT3-ITD mutant 32D hücrelerini (-80 ° C'de saklanır) hızla aktarın. Forseps kullanarak dondurarak saklama şişelerini alın ve kontrollü çözülmeyi tamamlamak için hemen sıcaklığı ayarlanmış bir su banyosuna (37 °C ± 0,5 °C) tam olarak 60 saniye daldırın. NOT: Çözdürme sırasında, eşit ısıtma sağlamak için dondurarak saklama şişelerini su banyosunda aralıklı olarak çalkalayın.</li>
		<li>Dondurularak saklanan numuneleri 150 × g'da 25 °C ± 1 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Hücresel peleti tutarken steril serolojik pipetler kullanarak süpernatanı dikkatlice aspire edin.</li>
		<li>Kriyoprezervasyon tüpüne 1 mL tam büyüme ortamı (RPMI 1640 +% 10 fetal sığır serumu +% 1 penisilin / streptomisin) ekleyin. Tam yeniden süspansiyon sağlamak için 10 ardışık pipetleme döngüsü (1 mL hacim) boyunca nazik öğütme gerçekleştirin. Hücre süspansiyonunu 100 mm'lik bir hücre kültürü kabına aktarın ve 8 mL'lik bir nihai hacim elde etmek için 7 mL tam ortam ekleyin.</li>
		<li>Kültür kabını beş yatay ve beş dönme hareketiyle hafifçe çalkalayın. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37.0 °C ± 0.2 °C'de %5CO2</li></ol></li><li><ol><li> <ol><li></ol></li><li> </li><li></li><li><ol><li><li> </li></ol></li><li></li><li> </li><li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68469/68469eq1.jpg" style="margin: auto;"> </li><li></li></ol></li><li><ol><li><li><li></li><li><li></li><li><ol><li></li><li><li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68469/68469eq2.jpg" style="margin: auto;"> </li></ol></li></ol></li></ol><ol><li><li><li></li><li><ol><li><ol><li><li><li></li></ol></li></ol></li></ol><ol><li> </li><li><li><li><li></li><li><li></ol><ol><li><ol><li></li><li></li><li></li></ol></li></ol>

<ol><li>Swaminathan, M., Wang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapies+for+AML%3A+A+round-up+for+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Novel therapies for AML: A round-up for clinicians.</a> Expert Rev Clin Pharmacol. 13 (12), 1389-1400 (2020).</li>
<li>Daver, N., Schlenk, R. F., Russell, N. H., Levis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+flt3+mutations+in+AML%3A+Review+of+current+knowledge+and+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Targeting flt3 mutations in AML: Review of current knowledge and evidence.</a> Leukemia. 33 (2), 299-312 (2019).</li>
<li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+classification+and+prognosis+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia.</a> N Engl J Med. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li>
<li>Mori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+FLT3%2FAXL+inhibitor%2C+shows+antileukemic+activity+in+mouse+models+of+FLT3-mutated+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+New+Drugs%22%5BJournal%5D)">a FLT3/AXL inhibitor, shows antileukemic activity in mouse models of FLT3-mutated acute myeloid leukemia.</a> Invest New Drugs. 35 (5), 556-565 (2017).</li>
<li>Papaemmanuil, E., Döhner, H., Campbell, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+classification+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Genomic classification in acute myeloid leukemia.</a> N Engl J Med. 375 (9), 900-901 (2016).</li>
<li>Cortes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quizartinib%3A+A+potent+and+selective+FLT3+inhibitor+for+the+treatment+of+patients+with+FLT3-ITD-positive+AML%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Quizartinib: A potent and selective FLT3 inhibitor for the treatment of patients with FLT3-ITD-positive AML.</a> J Hematol Oncol. 17 (1), 111(2024).</li>
<li>Döhner, H., Wei, A. H., Löwenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+precision+medicine+for+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Towards precision medicine for AML.</a> Nat Rev Clin Oncol. 18 (9), 577-590 (2021).</li>
<li>Kantarjian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukemia%3A+Current+progress+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+J%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukemia: Current progress and future directions.</a> Blood Cancer J. 11 (2), 41(2021).</li>
<li>Miyamoto, K., Minami, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge+molecular+therapy+for+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cutting edge molecular therapy for acute myeloid leukemia.</a> Int J Mol Sci. 21 (14), (2020).</li>
<li>Yang, X., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+therapy+for+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Precision therapy for acute myeloid leukemia.</a> J Hematol Oncol. 11 (1), 3(2018).</li>
<li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Olive, P. L., Banáth, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+Principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: Principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Azqueta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+recommendations+to+perform+the+alkaline+standard+and+enzyme-modified+comet+assay+in+human+biomonitoring+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Genet+Toxicol+Environ+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Technical recommendations to perform the alkaline standard and enzyme-modified comet assay in human biomonitoring studies.</a> Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 843, 24-32 (2019).</li>
<li>Cotelle, S., Férard, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay+in+genetic+ecotoxicology%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Comet assay in genetic ecotoxicology: A review.</a> Environ Mol Mutagen. 34 (4), 246-255 (1999).</li>
<li>Tice, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+gel%2Fcomet+assay%3A+Guidelines+for+in+vitro+and+in+vivo+genetic+toxicology+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Single cell gel/comet assay: Guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.</a> Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).</li>
<li>Pu, X., Wang, Z., Klaunig, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+comet+assay+for+assessing+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Alkaline comet assay for assessing DNA damage in individual cells.</a> Curr Protoc Toxicol. 65, 3.12.11-13.12.11 (2015).</li>
<li>Liu, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+flt3-itd+length+on+prognosis+of+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Impact of flt3-itd length on prognosis of acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 104 (1), e9-e12 (2019).</li>
<li>Wang, Y., Lin, X., Wang, Y., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+adavosertib+and+fimepinostat+on+acute+myeloid+leukemia+cells+by+enhancing+the+induction+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+New+Drugs%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of adavosertib and fimepinostat on acute myeloid leukemia cells by enhancing the induction of DNA damage.</a> Invest New Drugs. 42 (1), 70-79 (2024).</li>
<li>Kumar, S., Yedjou, C. G., Tchounwou, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic+trioxide+induces+oxidative+stress%2C+DNA+damage%2C+and+mitochondrial+pathway+of+apoptosis+in+human+leukemia+%28hl-60%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Arsenic trioxide induces oxidative stress, DNA damage, and mitochondrial pathway of apoptosis in human leukemia (hl-60) cells.</a> J Exp Clin Cancer Res. 33 (1), 42(2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Beyotime</td><td>ST066 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>1x YeaRed nükleik asit boyası</td><td>Evet</td><td>10202ES</td><td></td></tr><tr><td>32D HÜCRE</td><td>Biyo</td><td>CBP60995</td><td></td></tr><tr><td>AC220 Serisi</td><td>Hedef Mol</td><td>T2066 Hakkında</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Sayım Kiti-8</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Sayma Plakası</td><td>QiuJing Hakkında</td><td>XB-K-25 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatör</td><td>Termo</td><td>51032872</td><td></td></tr><tr><td>Comet tahlil yazılımı projesi (CASP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CometAssay Kit&nbsp;</td><td>Trevigen</td><td>4250-050-K</td><td></td></tr><tr><td>Sitasyon 5</td><td>BioTek</td><td>16280004</td><td></td></tr><tr><td>FBS'nin</td><td>TAVA</td><td>ST30-3302 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Gilteritinib</td><td>Hedef Mol</td><td>T4409 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prizma 9.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hızlı Santrifüj</td><td>Termo</td><td>&nbsp; 9AQ2861</td><td></td></tr><tr><td>L-1000XLS+ Pipetler</td><td>Yağmur</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>L-20XLS+ Pipetler</td><td>Yağmur</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı Azot Tankı</td><td>Kanser</td><td>YDS-175-216</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan FC mikroplaka fotometre</td><td>Termo</td><td>1410101</td><td></td></tr><tr><td>Na2OH</td><td>DAMAO</td><td>1588</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Güneş Enerjisi</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Solüsyonu, 100x</td><td>Beyotime</td><td>C0222 (İngilizce)</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 orta</td><td>Gibco</td><td>C22400500BT</td><td></td></tr><tr><td>Trinoküler canlı hücre mikroskobu</td><td>Motik</td><td>1.1001E+12</td><td></td></tr><tr><td>Ultra düşük sıcaklıklı dondurucu</td><td>Hayat</td><td>V118574</td><td></td></tr></tbody></table>

tip i ve tip ii flt3 İnhibitörlerine maruz kaldıktan sonra flt3 mutant eksprese eden 32d hücrelerde dna hasarını Ölçmek için kuyruklu yıldız testi

Comet Assay to Quantify DNA Damage in FLT3 Mutant-expressing 32D Cells after Exposure to Type I and Type II FLT3 Inhibitors

Kuyruklu yıldız tahlili, FLT3-mutant hücre hatlarında gilteritinib ve AC220 tarafından indüklenen diferansiyel DNA hasar profillerini ölçmek için sistematik olarak kullanıldı. Analizler, gilteritinib ve AC220 ile tedavi edilmeyen hücre popülasyonları arasındaki DNA hasarındaki farkın istatistiksel olarak anlamlı olmadığını gösterdi (P &gt; 0.05). Kuyruk DNA'sında (%) ve Zeytin Momenti Kuyruğunda (OMT) doza bağlı artışlar, 2-6 saatlik maruziyetlerden sonra istatistiksel anlamlılığa (P &lt; 0.05) ulaştı. OMT, kuyruktaki % ...

Tip I ve Tip II FLT3 İnhibitörlerine Maruz Kaldıktan Sonra FLT3 Mutant Eksprese Eden 32D Hücrelerde DNA Hasarını Ölçmek için Kuyruklu Yıldız Testi

FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3), a class III receptor tyrosine kinase, exhibits a mutation frequency of approximately 30% in acute myeloid leukemia ...

comet-assay-to-quantify-dna-damage-flt3-mutant-expressing-32d-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Video, zararlı ajanlara maruz kaldıktan sonra DNA hasarını tespit etmek için kuyruklu yıldız testini göstermektedir. Alkali koşullar altında, DNA gevşer ve denatüre olur ve elektroforez üzerine, hasar görmemiş ve hasar görmüş DNA, agaroz jeli içinde farklı şekilde göç ederek kuyruklu yıldız şeklinde bir yapı oluşturur. Yavaş göç eden hasarsız DNA, dairesel kuyruklu yıldız kafasını oluştururken, hızla göç eden hasarlı DNA parçaları, uzun kuyruklu yıldız kuyruğunu oluşturur.

Hücrelerde DNA Hasarı Tespiti için Comet Deneyi

Comet assay alkali labil siteleri ve hipokampal nöronlar da dahil olmak üzere tüm hücrelerde DNA üzerinde DNA-DNA/DNA-protein çapraz bağlantılar dahil tek ve çift zincir kırıkları, tespit etmenin en etkin yoludur. Yöntem DNA hasar miktarının farklılıklara bağlı olarak, bir elektrik alanı içinde DNA diferansiyel göç yararlanır.

Comet Assay kullanma Hipokampal Nöronlar DNA Hasarı assaying

Biz burada görülmemiş verimlilik ile DNA hasarı kuyrukluyıldız tahlil tespiti sağlayan bir platform açıklar. Cihaz desenler mikroarreylerinin içine memeli hücreleri ve 96 örneklerinin paralel işleme sağlar. Yaklaşımı temel düzeyde DNA hasarı, pozlama kaynaklı DNA hasarı ve DNA onarım kinetik analizini kolaylaştırır.

CometChip: İnsan Microarrayed hücrelerde DNA hasarına ölçülmesi için bir Yüksek verim 96 Oyuklu Platformu

Kuyruklu yıldız tahlil tek ve çift iplikçikli DNA içeren DNA hasarı tatili algılamak için verimli bir yöntemdir. Kemoterapi tedavi edici etkisini değerlendirmek için kanser hücrelerinin DNA hasarı ölçmek için alkali ve tarafsız kuyruklu yıldız deneyleri tarif.

Vitro DNA hasarı kuyruklu yıldız tahlil kullanarak değerlendirmek

Bu protokol, DNA hasarı değerlendirmek için kuyruklu yıldız testinde kullanılmak üzere nekropsi sırasında yüksek kaliteli dondurulmuş doku örnekleri hazırlamak için çeşitli prosedürler açıklar: 1) kıyılmış doku, 2) gastrointestinal sistemden kazınmış epitel hücreleri, ve 3) küp doku bir doku kıyma cihazı kullanarak homojenizasyon gerektiren örnekler.

DNA Hasarının Değerlendirilmesinde Kuyruklu Yıldız Testinde Donmuş Dokunun Kullanımı

Kuyruklu yıldız tahlili, DNA hasarını tespit etmenin popüler bir yoludur. Bu çalışma, kuyruklu yıldız testinin temsili varyantlarında slaytları çalıştırmaya yönelik bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bu yaklaşım, numune sayısını önemli ölçüde artırırken, tahlil çalışma süresini, slayt manipülasyonlarının sayısını ve jellere zarar verme riskini azalttı.

Hücresel DNA Hasarını Değerlendirmek için Yüksek Verimli Bir Kuyruklu Yıldız Testi Yaklaşımı

Gecikmiş tip aşırı duyarlılık (DTH) CCR7-efektör bellek T lenfositlerin aracılık ettiği inflamatuar bir reaksiyon. Burada Lewis sıçanlarda aktif DTH neden ve inflamatuar yanıt nasıl izleneceğini gösteriyor.

Sıçanlarda Aktif Gecikmiş tip aşırı duyarlılık (DTH) İndüksiyon ve İzlenmesi

Düzenleyici T hücreleri: Nakli Reddetme ve Tip I Diyabet Tedavisinde Terapötik Potansiyeli

Gecikmiş tip aşırı duyarlılık (DTH) CCR7-efektör bellek T (TEM) lenfositlerin aracılık ettiği inflamatuar bir reaksiyon. Burada, antijen spesifik TEM hücreleri aktive Lewis sıçanlarda evlatlık DTH neden ve inflamatuar yanıt izlemek nasıl göstermektedir.

Sıçanlarda Kabul edilmiş Gecikmeli-Tipi aşırı duyarlılık indüksiyonu ve İzleme

Ayrıntılı bir protokol görüntüleme için DNA onarım komplekslerin gerçek zamanlı oluşumu...

Görüntüleme Uyuşmazlığı DNA Hasar Onarım ve Hücresel Yanıtları Bacillus subtilis</em

Öğrenin, kuyruklu yıldız testiyle FLT3 mutant 32D hücrelerinde tip I ve tip II FLT3 inhibitörlerinin genotoksik etkilerini değerlendirin. AC220'nin Gilteritinib'den daha fazla DNA hasarına neden olduğunu keşfedin.

Tip I ve Tip II FLT3 İnhibitörlerine Maruz Kaldıktan Sonra FLT3 Mutant Eksprese Eden 32D Hücrelerde DNA Hasarını Ölçmek için Kuyruklu Yıldız Testi (Video) | JoVE Journal

Tip I ve Tip II FLT3 İnhibitörlerine Maruz Kaldıktan Sonra FLT3 Mutant Eksprese Eden 32D Hücrelerde DNA Hasarını Ölçmek için Kuyruklu Yıldız Testi

Daha fazla video keşfet