Tip I ve Tip II FLT3 İnhibitörlerine Maruz Kaldıktan Sonra FLT3 Mutant Eksprese Eden 32D Hücrelerde DNA Hasarını Ölçmek için Kuyruklu Yıldız Testi

32D FLT3 mutant hücreler üzerindeki tip I ve tip II FLT3 inhibitörlerinin genotoksisitesini sistematik olarak değerlendirmek için kuyruklu yıldız testini kullanıyoruz ve AML'de klinik optimizasyon için kritik veriler sağlıyoruz. İşlemler sırasında, mikrocerrahi aletinin yanlış kullanımı slaytı değiştirerek numune kaybına neden olur. Araştırmalar, tip II inhibitör olarak AC220'nin FLT3 mutant hücrelere daha ciddi DNA hasarı verdiğini ve terapötik direncin üstesinden gelmek için DNA hasarı hassasiyetinden yararlanarak kombinasyon tedavileri geliştirmek için önemli bilgiler sağladığını gösteriyor.

AML tedavisinde FLT3 inhibitörlerinin etki mekanizmasını araştırmak ve FLT3 inhibitörlerine dayalı ikili ilaç veya çoklu ilaç kombinasyon tedavisi stratejileri geliştirmek. Başlamak için, bir pipet kullanarak 1,5 mililitrelik tüplerde 10'a bir düşük erime noktalı agaroz ve hücre süspansiyonu karışımı hazırlayın ve hafifçe karıştırın. Agaroz hücre karışımının 55 mikrolitrelik kısımlarını, 45 derecelik bir açıyla tutulan bir pipet kullanarak kuyruklu yıldız slaytlarına dağıtın.

Daha sonra karışımla kaplanmış slaytları karanlık bir ortamda 30 dakika boyunca dört santigrat derecede yerleştirin. Katılaşmış slaytları önceden soğutulmuş lizis çözeltisine batırın ve slaytları ışıktan koruyarak dört santigrat derecede en az bir saat inkübe edin. Lizisten sonra, slaytları lizis çözeltisinden çıkarın.

Bir pipet tabancası kullanarak küreğin etrafındaki mümkün olduğu kadar fazla kalan sıvıyı dikkatlice emdirin. Ardından, slaytları alkali elektroforez tamponuna yerleştirin ve karanlıkta dört santigrat derecede bir saat boyunca ön dengelenmelerine izin verin. Şimdi slaytları elektroforez odasına yerleştirin.

Slaytları tamamen daldırmak için, yeterince önceden soğutulmuş alkalin elektroforez çözeltisi ekleyin. DNA hasarını azaltmak için önceden dengelenmiş bir tampon kullanarak elektroforezi 30 dakika boyunca sabit bir akımla 24 voltta çalıştırın. Elektroforezden sonra, alkalin elektroforez tamponunu slaytın etrafından aspire etmek için bir pipet tabancası kullanın.

Slaytları beş dakika boyunca çift damıtılmış suya batırın, ardından slaytları beş dakika boyunca %70 etanole batırın. Slaytları kuruması için 15 dakika boyunca 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin. Ardından, slaytın her bir oyuğuna 100 mikrolitrelik bir YeaRed nükleik asit boyası alikotu uygulayın.

Slaytları ışıktan korunan bir ortamda 28 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Fazla lekeyi çıkarmak için slaytları suyla hafifçe durulayın ve 37 santigrat derecelik bir inkübatörde kurutun. Kuyruklu yıldız tahlili, FLT3 mutant hücre hatlarında Gilteritinib ve AC220 tarafından indüklenen diferansiyel DNA hasar profillerini ölçmek için sistematik olarak kullanıldı.

Kuyruk DNA yüzdesinin kantitatif analizi, her iki bileşiğin de iki, dört ve altı saat sonra DNA hasarını önemli ölçüde artırdığını ve AC220'nin her zaman noktasında Gilteritinib'den daha yüksek hasar seviyeleri ürettiğini doğruladı. Tüm moment kuyruk ölçümleri, her iki tedavi için de iki saatten altı saate istatistiksel olarak anlamlı artışlar ve baştan sona AC220 grubunda gözlemlenen daha yüksek OTM değerleri ile kuyruk DNA eğilimini yansıttı.