Doğal Kaynaklardan Protein Sentezi İnhibitörlerinin Ön Taraması için Flüoresans Tabanlı Protokol

Doğal kaynaklardan protein sentezi inhibitörlerinin ön taraması için floresan tabanlı bir protokol. Protein sentezi, yüksek derecede düzenlenmiş süreçler, transkripsiyon ve çeviri içerir. Transkripsiyon öncelikle transkripsiyon faktörleri, kromatin modifikasyonları ve düzenleyici RNA'lar tarafından düzenlenir.

Çeviri ise başlatma faktörleri, sinyal yolları ve RNA stabilite mekanizmalarıyla düzenlenir. Bu düzenleyici sistemler, hücrelerin hücresel işlevlerini sürdürmesini ve stres veya hasara etkili şekilde yanıt vermesini sağlar. Kanser hücreleri, yüksek enerji taleplerini ve kontrolsüz büyümelerini desteklemek için translasyon mekanizmalarını ele geçirerek protein sentezini düzensizleştirir.

Bu yeniden programlama, neredeyse tüm ana onkojenik sinyal yollarının düzensizliğinin bir sonucudur; bu da hücre hayatta kalma, çoğalma ve metastazı desteklerken hücre ölüm yollarını baskılar. Bu gelişmiş protein sentezi kanserin hayatta kalması için kritik olduğundan, bu süreci hedefleyen ve engelleyen tedaviler potansiyel tedavi olarak umut vaat ediyor. Protein sentezi inhibitörlerini belirlemek için aşağıdaki protein sentezi inhibisyon floresan testi kullanılabilir.

Deneye başlamadan önce, güvenilir sonuçlar elde etmek için, bileşiklerin toksisite eşiğinin altında uygun bir konsantrasyonda uygulanması gerekir. Başlangıç konsantrasyonu belirlemek için, bileşiğin EC 50'sini belirlemek için bir sitotoksisite testi yapılmalıdır. Eğer bu mümkün değilse, bu testteki bileşikler doza bağlı olarak test edilerek en etkili konsantrasyon parametreleri belirlenebilir.

Bileşik konsantrasyonu hücre ölümünü tetiklerse, düşük konsantrasyonlarda test yapmak gerekir. Ayrıca, kullanılmadığı zamanlarda boyaları ışıktan korumak da önemlidir. Uzun süreli ışık maruz kalma fotobeyazmaya yol açar ve bu da veri kalitesinin zayıflamasına yol açar.

Adım 3.1, ana karışım A'yı hazırlayın, bir santrifüj tüpünü A olarak etiketleyin, ardından 598,5 mikrolitre kültür ortamı ve 1,5 mikrolitre protein etiketi A'ya pipet yapın. Bu karışımı tekrar askıya alın, böylece yukarı aşağı pipetle homojenliği sağlanır. Şimdi ana karışım B. Santrifüj tüpünü B olarak etiketleyin, ardından 1,5 mikrolitre protein etiketi, 6,6 mikrolitre sikloheksimid ve 591,9 mikrolitre kültür ortamı B'ye pipetleyin. Bu karışımı yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenliği sağlamak için yeniden askıya alın. Bir mikrolitre test bileşiği ve bir mikrolitre araç iki kuyuya pipetlendikten sonra, 99 mikrolitre ana karışım A'yı her iki kuyuya nazikçe pipetleyin, hücrelerin kinetik bozulmasını önlemek için kuyunun yanına açılı şekilde pipetleyin.

100 mikrolitre master karışım B'yi iki aranmamış kuyuya pipitleyin. Hücrelerin kinetik bozulmasını önlemek için kuyunun kenarına açılı şekilde pipet yapın. İstenen bileşenlerin hücrelere tam olarak dahil edilmesini sağlamak için plakaya nazikçe dokunun.

Hücreleri 37 derece Celsius'ta 30 dakika ile iki saat arasında kuluçka edin. Hücre kültür ortamını aspirasyon yoluyla çıkarın. Plakayı eğip kuyunun ortasından değil kenardan aspirasyon yapın, böylece hücrelerin kinetik bozulmasını önleyin.

Sonra her kuyuya 100 mikrolitre PBS tamponu ekleyip plakayı 900g ile beş dakika boyunca santrifüjle yapın. Santrifüjlemeden sonra, PBS tamponunu aspirasyon yoluyla çıkarmayı unutmayın. Beşinci adım, takıntı ve geçirimlilik.

Her kuyuya 100 mikrolitre fiksatif çözelti ekleyin. Sonra hücreleri oda sıcaklığında karanlık bir ortamda 15 dakika kuluçka altına alın. Sonra hücreleri aspire edin.

Hücreleri 100 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın ve aspirasyon yoluyla çıkarın. Bunu iki kez tekrarlayın. Her kuyuya 100 mikrolitre geçirimlilik tamponu ekleyin.

Bundan sonra, oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın. Geçirimlilik tamponunu aspirasyon yoluyla kaldırın. Altıncı adım, protein reaksiyonu ve boyama.

Reaksiyon kokteyl master karışımını hazırlayın. Santrifüj tüpüne 651 mikrolitre PBS tamponu ekleyin. Sonra yedi mikrolitre 100x bakır reaktif ekleyin.

Sonra yedi mikrolitre floresan azid. Son olarak, santrifüj tüpüne 35 mikrolitre indirgeme maddesi ekleyin. Reaktifleri eklerken tam olarak bu sırayı takip edin, ardından her kuyuya 100 mikrolitre reaksiyon kokteyli ekleyin.

Hücreleri oda sıcaklığında karanlık bir ortamda 30 dakika kuluçka altına alın, böylece foto ağartmayı önleyin. Hücreleri 900g ile beş dakika boyunca santrifüj yapın. Solu, hücreleri yıkayın ve sonra tekrar aspirasyon yapın.

Toplam DNA boyasını 1x seyreltme yapın ve her kuyuya 100 mikrolitre ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında karanlık bir ortamda 20 dakika kuluçka altına alın, böylece foto ağartmayı önleyin. Plakayı 900g ile beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Hücreleri 100 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayıp aspirasyon yoluyla çıkarın. Bu adımı iki kez tekrarlayın. Son olarak, hücreleri görüntülemeye hazırlamak için 100 mikrolitre soğuttulan PBS tamponu ile yeniden askıya alın.

Sekizinci adım, görüntüleme. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve büyütmeyi 20 x ayarlayın. Çekirdek boyasını GFP 469/525 nanometre kanalıyla analiz edin.

Görüntüleme sonuçlarını artırmak için otomatik bükülme ve otomatik odaklama kullanın. Texas Red 586/647 nanometre kanalıyla aktif protein sentezini analiz edin. Görüntüleme sonuçlarını artırmak için otomatik bükülme ve otomatik odaklama kullanın.

Floresan problar, ışıkla yapılan radyasyonun floroforların floresan özelliklerini kaybetmesine neden olduğu bir olgu olan fotobeyazmaya karşı hassastır. Boyalar, kullanılmadıkları zamanlarda her zaman ışıktan korunmalıdır. Ayrıca, her kuyu içindeki tarama sayısı ve ışınlanan ışık altında zaman sınırlandırılmalıdır.

Uzun süreli ışık maruz kalma foto ağartmaya yol açar ve bu da nihayetinde veri kalitesinin bozulmasına yol açar. Temsilci sonuçlara bakalım. Burada canlı hücreler yeşil renkte görülür ve aktif protein sentezi kırmızı ile gösterilir.

Bilinen protein sentezi inhibitörü sikloheksimid, şekil 1B'de görüldüğü gibi, şekil 1A'daki negatif kontrol DMSO'ya kıyasla protein sentezinde büyük bir azalmaya yol açar; kırmızı floresan ışık daha az yayılır. Şekil 1C'de görüldüğü gibi bileşik bir ile tedavi ya hücre ayrılması ya da hücre ölümü ile sonuçlandı. Bu nedenle, protein sentezi inhibisyon aktivitesi hakkında kesin bir iddiada bulunamayız.

Bu, daha düşük konsantrasyonlarda protein sentezini engelleyip engellemediğini belirlemek için daha fazla doz yanıtı çalışmalarını gerektirir. İkinci bileşik, şekil 1D'de belirtildiği gibi orta düzeyde protein sentezi inhibisyonu gösterir. Bu florometrik test, lisans öğrencilerini eğitmek için değerli bir araştırma aracı ve erişilebilir bir kimyasal biyoloji yöntemidir.

Erişilebilir, verimli ve minimum veri işleme protokolü sunarak öğrencilere uygulamalı deneyim ve modern ilaç keşif teknikleri sunar ve ilaç keşfi sürecini hızlandırır. Protokol, bir floresan substrat ve gelişmiş floresan mikroskopi teknikleri kullanarak doğal ürün bileşikleri birinci ve iki bileşenlerin inhibitör yeteneklerini sistematik olarak tespit edip ölçer. Referans inhibitörü olarak sikloheksimidi kullanarak, her iki doğal ürün de protein sentezi inhibisyonunda farklı seviyelerde bulundu.

Yeni protein sentez inhibitörlerine olan talep arttıkça, bu yaklaşım lisans öğrencilerine anlamlı araştırma fırsatları sunarken kanser tedavilerindeki ilerlemelere katkıda bulunur.