Diziye Özgü Nükleik Asit Analizi için Sinyal Raportörü Olarak DNA Floresan Işıklı Aptamer Kullanan Bölünmüş Hibridizasyon Probu
July 8th, 2025
Bu protokol, bir sinyal raportörü olarak floresan ışıklı aptamer DAP-10-42 kullanan bölünmüş hibridizasyon problarının tasarımını ve bunların nükleik asit tespiti ve tek nükleotid ikameleri ile hedefler arasında farklılaşma için uygulamalarını ana hatlarıyla belirtir.
Diziye özgü nükleik asit analizi için yeni tip floresan hibridizasyon probları geliştiriyoruz. Son zamanlarda, hibridizasyon analiz araçları, CRISPR-Cas sistemlerinden yararlanan tahlillerle genişledi. Şu anda, TaqMan gibi son teknoloji hibridizasyon probları ve moleküler işaret probları, nükleik asit hedeflerini analiz etmek için en çok kullanılmaktadır.
Tek nükleotid ikamelerinin ve nükleik asit hedeflerinin doğru tespiti hala pratik olarak zordur. Protokolümüz, etiketsiz bir floresan sinyali okuması sağlarken gerekli hücre aktivitesi seviyesini sağlar. Başlamak için, SLAS'ı oluşturan iki değiştirilmemiş DNA oligonükleotit zincirinin dizilerini tasarlayın.
DAP-10-42'nin 6 ila 39'u için nükleotid içeren bir fragman kullanın. 1 ila 8 ve 36 ila 42 nükleotidlerinden oluşan gövde 1'i, 5. pozisyonda şişkin bir timini çıkararak, gövdeyi dört baz çiftine kısaltarak ve bir terminal sitozin-guanin baz çifti ekleyerek gövde 1 asalına dönüştürün. Bir SLAS zincirine 9 ila 29 nükleotidleri ve diğerine 30 ila 35 nükleotidleri dahil edin.
Deoksi GGTCAT ekleyerek parçanın üç asal terminal dizisini 9 ila 29 nükleotidleri ile uzatın. Daha sonra, altı bazlı bir çift gövde 2 oluşturmak için 30 ila 35 fragmanın beş asal terminal dizisini deoksi TGACC ile uzatın. Şimdi deoksi TT bağlayıcıları ve nükleik asit hedefini tamamlayıcı DNA dizileri ile her iki iplikçikte gövde 1 asal uzatın.
Bu, probu oluşturan SLAS-U ve SLAS-S ipliklerinin dizilerini verir. SLAS-S'yi 7 ila 10 nükleotid bölgesine tamamlayıcı yapın. Bu, tek nükleotid ikame bölgesini içerir.
Ardından, SLAS-U'nun hedef bağlanma kolunun, SLAS-S bölgesine bitişik 15 ila 25 nükleotid fragmanına tamamlayıcı olduğundan emin olun. UNAFold web sunucusunu kullanarak hedef bağlama dublekslerinin erime sıcaklıklarını değerlendirin. INAMelt sekmesine tıklayın.
Uygulamalar'a gidin ve İki Durumlu Erime Hibridizasyonu'nu seçin. Etkileşen dizileri sol ve sağ kutulara beş asal ila üç asal sırada girin. Daha sonra tahlil sıcaklığını 22 santigrat dereceye ayarlayın ve tek değerlikli ve iki değerlikli katyon konsantrasyonlarını sırasıyla 20 milimolar ve 25 milimolar iyonlara girin.
İlgili kutuda etkileşen dizilerin konsantrasyonlarını ayarlayın. Gönder'e basın ve ilgili dubleksler için Gibbs enerji değişimi, entalpY, entropi ve erime sıcaklığı değerlerini inceleyin. Mükemmel eşleşen hedefler için erime sıcaklıklarının ve SLAS-S ve SLAS-U'nun hedef bağlama kollarının test sıcaklığının, 22 santigrat derecenin üzerinde olduğunu doğrulayın.
Özgüllüğü korumak için SLAS-S ile uyumsuz bir hedef arasındaki dubleksin, tahlil sıcaklığının altında erime sıcaklıkları verdiğinden emin olun. Gerekirse, hedef bağlama kollarının uzunluklarını bu koşulları karşılayacak şekilde ayarlayın. Nihai SLAS-U ve SLAS-S oligonükleotit zincirlerini ticari bir DNA tedarikçisinden alın veya otomatik bir DNA sentezleyici kullanarak bunları şirket içinde sentezleyin.
Auramine O, SLAS-S, SLAS-U ve tahlil tamponunun stok çözeltilerini hazırlayın. Hedef dışındaki tüm tahlil bileşenlerini içeren ana karışımı hazırlayın. Ana karışımın son beşe altıncı hacmine nükleaz içermeyen su ekleyin.
Ardından ana karışımı vorteksleyin ve döndürün. Her numune tüpüne 50 mikrolitre dağıtın. Ardından, bir örneği hedef olmayan boşluk ve diğerini pozitif kontrol olarak etiketleyin.
60 mikrolitrelik bir numune yapmak için ana karışımı içeren bir tüpe 10 mikrolitre hedef içeren numune ekleyin. Boşluk için 10 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Daha sonra hedef diziyi içeren 10 mikrolitre sentetik DNA oligonükleotidi pozitif kontrol tüpüne pipetleyin.
Tüm numuneleri bir mikrosantrifüj kullanarak santrifüjde kısaca karıştırın. Ardından tüpleri 22 santigrat derecede 10 ila 60 dakika inkübe edin. Bir floresan spektrofotometre kullanarak 475 nanometrede uyarıldığında floresansı 540 nanometrede ölçün.
SLAS, NANOGP8 geninin belirli bir parçasını hedef alacak şekilde uyarlanmıştır. Hedef M, SLAS-S zincirini tamamen tamamlayıcıydı, hedef MM ise SLAS-S ile bir uyumsuzluk ortaya çıkaran bir sitozin nükleotid pozisyonu 1, 423'e sahipti. Tamamen tamamlayıcı hedef M'nin eklenmesi üzerine, floresan istikrarlı bir şekilde arttı ve 45 ila 50 dakika sonra plato yaptı.
Bununla birlikte, 10 SLAS'lık bir sinyal-boşluk oranıyla 10 dakika içinde net bir sinyal tespit edilebildi, tam olarak eşleşen hedefler için yüksek floresan sinyali gösterdi, ancak eşleşmeyen hedefler veya boşluklar için değil. Floresan çıkışı, 500 nanomolara kadar hedef konsantrasyonla doğrusal olarak arttı, bu da ölçüm limitlerinin ölçülmesini ve belirlenmesini sağladı. PCR ile güçlendirilmiş numuneler, yalnızca Numune 2'nin floresan eşik değeri olan 2'yi aşmasıyla değişen seviyelerde sinyal gösterdi.
Kalibrasyon eğrisine dayanarak, Örnek 2'deki NANOGP8 amplikon konsantrasyonunun 124+ veya 13 nanomolar olduğu tahmin edilmiştir. SLAS sinyalinin floresan tespiti, hem tezgah üstü spektrofotometrede hem de taşınabilir bir florometrede tutarlıydı. UV ışığı kullanılarak 20'nin üzerinde bir sinyal-boşluk oranı da görsel olarak gözlemlendi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, özel nükleik asit analizi için floresan hibridizasyon sondalarının geliştirilmesini açıklamakta olup, sinyal raportörü olarak DAP-10-42 kullanımına odaklanmaktadır. Tek nükleotid ikamelerinin tespitindeki zorlukları ele almaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Floresan hibridizasyon sondaları
- Nükleik asit tespiti
- Tek nükleotid ikameleri
Arka Plan
- Mevcut hibridizasyon analiz araçları arasında TaqMan ve moleküler işaretçi sondaları bulunmaktadır.
- Nükleik asit hedeflerinin doğru tespiti zor olmaya devam etmektedir.
- CRISPR-Cas sistemleri, hibridizasyon analiz yeteneklerini genişletmiştir.
- Etkili analiz için etiketsiz floresan sinyal çıkışları esastır.
Çalışmanın Amacı
- Gelişmiş nükleik asit tespiti için bölünmüş hibridizasyon sondaları tasarlamak.
- Tek nükleotid ikameleri olan hedefler arasında ayrım yapmak.
- Hücre aktivitesini sağlarken doğru floresan sinyalleri sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- İki değiştirilmemiş DNA oligonükleotid zincirinin tasarımı.
- Floresan aydınlatma aptamer DAP-10-42'nin kullanımı.
- Nükleik asit analizinde bölünmüş hibridizasyon sondalarının uygulanması.
- Sinyal çıkış verimliliğinin değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Bölünmüş hibridizasyon sondalarının başarılı tasarımı.
- Nükleik asit hedeflerinin etkili ayrımı.
- Etiket gerektirmeyen floresan sinyal çıkışının gösterilmesi.
- Tek nükleotid ikamelerin tespitinde gelişmiş doğruluk.
Sonuçlar
- Geliştirilmiş sondalar, nükleik asit tespit yeteneklerini artırmaktadır.
- Tek nükleotid varyasyonlarını analiz etmek için güvenilir bir yöntem sunarlar.
- Bu yaklaşım, nükleik asit analizi alanını ilerletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Sequence-specific nucleic acid analysis using split hybridization probes with DNA fluorescent light-up aptamers (FLAPs) addresses the persistent challenge of detecting single-nucleotide substitutions with high specificity and quantitative confidence. This approach enables label-free, cost-effective, and scalable fluorescence-based readouts, supporting robust target validation and mechanistic de-risking in early discovery and screening workflows. The method's selectivity and quantitative outputs are directly relevant for portfolio triage and risk-adjusted advancement decisions in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting single-nucleotide substitutions with high selectivity.
- Supports functional target validation through quantitative, sequence-specific fluorescence outputs.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing perfectly matched from mismatched nucleic acid targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, label-free assay systems for downstream screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative fluorescence measurements for assay development.
- Enables rapid, scalable, and portable screening readiness using conventional or handheld fluorescence detection platforms.
Translational & Preclinical Research
- Supports translational biomarker alignment by enabling detection of clinically relevant single-nucleotide variants.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation with quantitative, sequence-specific outputs.
- Reduces biological risk by enabling precise discrimination of target variants in complex samples.
Pipeline & Workflow Integration
This split hybridization probe platform integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing, assay development, and translational biomarker validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by enabling sequence-specific nucleic acid detection.
- Screening: Provides reproducible, quantitative fluorescence outputs for reliable compound or target evaluation.
- Analytics: Delivers measurable readouts and statistical discrimination between matched and mismatched targets.
- Translational Research: Aligns with biomarker-driven studies by enabling detection of single-nucleotide variants in disease-relevant samples.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, label-free detection capability adaptable across diverse nucleic acid targets and workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and target validation by enabling single-nucleotide resolution.
- Operational Value: Standardizes and simplifies assay workflows with label-free, scalable detection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid probe design and melting temperature analysis.
- Needs access to fluorescence spectrophotometers or portable fluorometers for quantitative readout.
- Demands cross-team standardization of probe synthesis and assay conditions for reproducibility.
- Adaptable to various nucleic acid targets by customizing complementary sequences and probe arms.
- Specificity depends on careful optimization of probe-target duplex stability and assay temperature.
