Name: Diziye Özgü Nükleik Asit Analizi için Sinyal Raportörü Olarak DNA Floresan Işıklı Aptamer Kullanan Bölünmüş Hibridizasyon Probu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-08T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Öğrenin, DAP-10-42 floresan aptameri kullanan bölünmüş hibridizasyon probları ile tek nükleotid değişimlerini hassas şekilde tespit etme yöntemini. Bu etiketsiz analiz, nükleik asit hedeflerinin güvenilir şekilde ayırt edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Sinyal muhabiri olarak DAP-10-42 ile Bölünmüş Işıklı Aptamer Sensörünün (SLAS) tasarımı
<ol>
	<li>SLAS'ı oluşturan iki değiştirilmemiş DNA oligonükleotid zincirinin dizilerini tasarlayın. DAP-10-42'nin 4,6-39 nükleotidlerini (nts) içeren bir parça kullanın (Tablo 1, Şekil 1A).</li>
	<li>Kök 1 (nts 1-8 ve 36-42) dizisini, nt 5 konumunda şişkin bir timin kalıntısını çıkararak, gövdeyi 4 bp'ye kısaltarak (nts 4,6-8 ve 36-39) gövde 1'e dönüştürün ve bir terminal CG bp ekleyin (Şekil 1A, adım 1). Ek olarak, SLAS dizilerinden biri DAP-10-42 çekirdek dizisinin nts 9-29'unu içerirken, başka bir SLAS dizisi dizinin nts 30-35'ini içerir.</li>
	<li>nts 9-29 içeren fragmanın 3'-terminal dizisini d(GGTCAT) ile ve nts 30-35 fragmanının 5'-terminal dizisini d(ATGACC) ile 6-bp'lik bir gövde 2 oluşturacak şekilde genişletin (Şekil 1A, adım 2). NOT: Aptamerin aydınlatma işlevi için DAP-10-42'deki gövde 1'in T4-A39, A6-T38, C7-G37 ve G8-C36 baz çiftleri gereklidir. Kök 1' dizisi yalnızca terminal bp'de değiştirilebilir ve bir G-C, AT, T-A baz çifti olabilir veya gerektiği gibi 1-2 baz çifti ile genişletilebilir. Kök 2'nin sırası isteğe bağlıdır ve değiştirilebilir. Bununla birlikte, tahlil sıcaklığı 28 °C'nin üzerine çıkarılmadıkça gövde 2'nin termodinamik stabilitesinin korunması önerilir. Gövde 2'nin kısaltılması veya başka bir şekilde dengesizleştirilmesi, SLAS bazlı floresan testinin yüksek bir arka planı gözlenirse, hedef olmadan erken boya bağlanmasını önler. DAP-10-42 nükleotid dizisinin nts 29-30 yerine nts 28-29, 27-28 veya 26-27 arasında bölünmesine de izin verilir (Şekil 1B).</li>
	<li>Tasarlanan SLAS'ı bir nükleik asit hedefine veya ilgisine uyarlamak için, d(TT) bağlayıcıları aracılığıyla hedef-hedef bağlama fragmanlarına (kollar) tamamlayıcı DNA dizileri ile kök 1'i uzatın (Şekil 1A, adım 3). Bu, probu oluşturan SLAS-U ve SLAS-S dizilerini verir.</li>
	<li>SLAS-S'nin hedef bağlama kolunu, SNS bölgesini içeren hedefin 7-10 nt'lik bir fragmanına tamamlayıcı hale getirin ve SLAS-U'nun hedef bağlama kolunu - SLAS-S'nin hedef bağlama koluna bitişik hedefin 15-25 nt'lik bir fragmanına tamamlayıcı hale getirin (Tablo 1). NOT: SLAS-S'nin hedef bağlama kolunun DAP-4-39 dizisinin nt 10 veya nt 42'una bağlanıp bağlanmayacağı isteğe bağlıdır (sırasıyla Şekil 1, kol 1 veya kol 2).</li>
	<li>UNAFold Web Sunucusunu (unafold.org)19 kullanarak, ilgilenilen hedef ile SLAS-S ve SLAS-U'nun hedef bağlama kolları arasındaki dublekslerin erime sıcaklığını (Tm) değerlendirin.<ol>
		<li>Web sayfasının üst kısmındaki DINAMelt sekmesine tıklayın; Uygulamalar'a gidin ve İki Durumlu Erime Hibridizasyonunu seçin (Ek Şekil 3A). İki Durumlu Erime Hibridizasyonu'nun (Two-State Melting Hybridization) sayfasında, etkileşim dizilerinden birini soldaki kutuya ve diğerini sağdaki kutuya girin (Ek Şekil 3B). Her iki dizinin de 5' ila 3' sırada olduğundan emin olun. Noktalı virgülle ayırarak birden fazla etkileşim dizisi çifti girebilirsiniz.</li>
		<li>Sayfanın alt kısmında, tahlil koşullarına uyması için tahlil sıcaklığını (22 °C), tek değerlikli ve iki değerlikli katyon konsantrasyonlarını (sırasıyla 20 mM ve 25 mM) belirtin. Etkileşen dizilerin konsantrasyonunu belirtin.</li>
		<li>Gönder'e basın (Ek Şekil 3B). Gibbs enerji değişimini, entalpi değişimini ve bağlamanın entropi değişimini ve ayrıca karşılık gelen dubleksler için Tm değerlerini içeren sonuçları gözlemleyin (Ek Şekil 3B).</li>
		<li>Tam eşleşen hedef (M) ile SLAS-S ve SLAS-U'nun hedef bağlama kolları arasındaki dubleksler için Tm değerlerinin, mevcut protokolde 22 °C olan tahlil sıcaklığının üzerinde olduğundan emin olun. Burada, Tm değerleri sırasıyla 32.2 ° C ve 74.4 ° C idi (Ek Şekil 3C).</li>
		<li>SLAS-S ile SNS içeren eşleşmeyen bir hedef (MM) arasındaki çift yönlülüğün tahlil sıcaklığının altında bir Tm olduğundan emin olun. Bu, prob hedefi tanımanın yüksek seçiciliğini sağlar ve AO florojeninin, SLAS bağlayıcı fragmanda bir SNS içeriyorsa hedeflenen nükleik asit analitinin varlığını işaret etmesini önler (Şekil 2). Burada, Tm 21.3 °C idi (Ek Şekil 3C), bu da uyumsuzluğu eşleşen kompleksten ayırt etmek için yeterliydi.</li>
		<li>Belirtilen stabilite gereksinimlerini karşılamak için gerekirse, hedefi tamamlayan parçaları kısaltarak veya uzatarak hedef bağlama kollarının dizilerini ayarlayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tasarlanan SLAS-S ve SLAS-U ipliklerini, özel yapım DNA oligonükleotidleri tedarik eden herhangi bir ticari satıcıdan edinin veya otomatik bir oligonükleotid sentezleyici kullanarak DNA ipliklerini şirket içinde sentezleyin.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig1.jpg"> 
Şekil 1: Bir floresan ışıklı aptamer (FLAP) DAP-10-42'nin bölünmüş ışıklı aptamer sensörüne (SLAS) dönüştürülmesi. (Bir)DAP-10-4212'nin ikincil yapısı, UNAFold Web Sunucusu19'un 22 °C, 20 mM Na+, 25 mM Mg2+'da bir DNA katlama uygulaması ile tahmin edilir. Aptamer, muhtemelen gövde 1 tarafından stabilize edilmiş bir G-dörtlü motife katlanan bir çekirdeğe sahip bir saç tokası ikincil yapısına sahiptir. DAP-10-42'nin bir SLAS'a dönüştürülmesi için, (1) aptamerin 1 gövdesi 4 bp'ye kısaltılır ve gövde 1' yapmak için ek bir GC bp ile çevrelenir; (2) çekirdek dizi, NTS 29 ve 30 arasında bölünür, bölme bölgesinin 3'- ve 5' tarafları, gövde 2'yi yapmak için sırasıyla d(GGTCAT) ve d(ATGACC) tamamlayıcı dizileri ile genişletilir; (3) kök 1', hedef bağlama kolları ile probun sinyal raporlama alanı arasında bir d(TT)-bağlayıcı ile, ilgilenilen bir hedefin - hedef bağlama kollarının bitişik parçalarına tamamlayıcı dizilerle uzatılır. (B) Çekirdek ayrıca sinyalde önemli bir kayıp ve/veya floresan katlama artışı olmadan nts 28-29, 27-28 veya 26-27 arasında bölünebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig2v2.jpg"> 
Şekil 2: SLAS sinyal üretim mekanizması. SLAS, SLAS-U ve SLAS-S olmak üzere iki iplikten ve florojenik bir boyadan (örneğin, Auramine O; AO) tarafından desteklenmektedir. İlgilenilen bir nükleik asit hedefinin yokluğunda, her iki iplik de ayrışmış durumdadır ve boyayı bağlayamaz; Sinyal gözlenmiyor (ortada). Tam olarak eşleşen bir hedef M'nin varlığında, hem SLAS-U hem de SLAS-S, çekirdek parçaları yakınlaştırmak için M'nin bitişik parçasına hibritleşir. Bu, boya bağlama bölgesinin oluşumuna izin verir. AO'nun bağlanması, floresan sinyal okuması (solda) olarak ölçülen floresansını arttırır. SLAS-S ile etkileşime giren bir parçada tek nükleotid ikamesi (SNS) içeren eşleşmeyen bir hedef MM'nin varlığında, SLAS-S ayrışmış durumdayken, yalnızca SLAS-U MM hedefine hibritleştirebilir. Bu, boya bağlama bölgesinin oluşumunu önler ve hiçbir sinyal gözlenmez (sağda). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
2. Hedeflenen dizinin amplifikasyonu
<ol>
	<li>SLAS testi ile analiz edilecek genin bir parçasını çoğaltın. PCR veya RPA amplifikasyonu için, tek sarmallı bir amplikon oluşturmak için asimetrik koşullar kullanın (örneğin, Ters Astar üzerine 10 kat fazla İleri Astar eklendiğinde). Üstel (LATE) PCR20 kullanarak NANOGP8 geninden 126 nt'lik bir fragmanı amplifiye etmek için, Tablo 2'de listelenen primer dizilerini kullanın. Burada, genin 126-nt fragmanına karşılık gelen tek sarmallı bir DNA şablonu (Şablon NANOGP8 veya Şablon G1423C, Tablo 2) kullanıldı. Şablon, Integrated DNA Technologies, Inc. tarafından özel olarak sentezlendi.<ol>
		<li>10 μL 10x Standart Taq Reaksiyon Tamponu, 2 μL 10 mM dNTP karışımı (0.2 mM nihai konsantrasyona sahip olmak için), 10 μL 10 μM İleri astar ve 10 μL 1 μM Ters Astarı (1 μM ve 0.1 μM nihai konsantrasyon için) karıştırarak 100 μL'lik bir PCR reaksiyonu hazırlayın, sırasıyla), 0.5 μL 5U/μL Taq DNA polimeraz, DNA şablonu ve nükleaz içermeyen su. Şablon içermeyen bir denetim için şablon yerine su ekleyin.</li>
		<li>Aşağıdaki termodöngü koşullarını kullanın: 1 dakika boyunca 95 ° C'de ilk denatürasyon; 45 döngü (1) 15 saniye boyunca 95 ° C'de denatürasyon, (2) 30 saniye boyunca 60 ° C'de astar tavlama, (3) 30 saniye boyunca 68 ° C'de astar uzatma; ve son uzatma 68 ° C'de 5 dakika. NOT: NASBA18 gibi transkripsiyon tabanlı amplifikasyon teknikleri, özellikle amplifikasyon için bir RNA şablonu mevcutsa, PCR veya RPA yerine kullanılabilir. NASBA, mikromolar aralıkta nihai ürün konsantrasyonunda tek sarmallı bir RNA amplikonu üretir, bu da ürün konsantrasyonu olmadan aşağı akış SLAS testinde kullanılabilecek kadar yüksektir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0.1x hacim 3 M sodyum asetat (pH 5.5) ve 3x hacim etanol ekleyerek amplifiye edilmiş numuneleri etanol ile çökeltin. -20 ° C'de 1 saat inkübe edin, 12.000-18.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.</li>
	<li>Peletleri p etanol ile yıkayın, yeniden santrifüjleyin ve süpernatanı tekrar atın. Peleti havayla kurutun ve SLAS tahlilinde kullanılmak üzere 10 μL nükleaz içermeyen suda çözün.</li>
</ol>
3. SLAS kullanarak floresan deneyi
<ol>
	<li>AO (DMSO'da 0.1 mM, 10x), SLAS-S (nükleaz içermeyen suda 10 μM, 10x), SLAS-U (nükleaz içermeyen suda 10 μM, 10x) ve 4x tahlil tamponu (80 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM MgCl2, 80 mM KCl) stok çözeltileri hazırlayın. NOT: Potasyum iyonları, boya bağlama bölgesinin bir parçası olan aptamerin varsayılan G-dörtlü motifini stabilize etmek için gereklidir. 1x tahlil tamponunda 1 mM KCl (25 mM MgCl2'de) kadar az, boşluk üzerinde spesifik hedef M'nin varlığında ~ 14 kat floresan artışı sağlamak için yeterlidir (hedefsiz numune; Ek Şekil 2B). Magnezyum iyonları, nükleik asit ipliklerinin etkileşimlerini stabilize eder (SLAS-S, SLAS-U ve hedef arasında). 1x Test Tamponundaki Mg2 + konsantrasyonu en az 5 mM olmalıdır (20 mM KCl'de; Ek Şekil 2C,D). AO'nun stok çözeltisi (~ 1 mM) DMSO'da hazırlanır. SLAS-S ve SLAS-U'nun stok konsantrasyonları isteğe bağlıdır ve tellerin nihai konsantrasyonları korunduğu sürece gerekirse ayarlanabilir (Tartışmadaki nihai SLAS konsantrasyonunun seçilmesi için gerekçeye bakın). DİKKAT: AO yutulduğunda zararlıdır, cilt ile temasında toksiktir ve kansere neden olduğundan şüphelenilir. AO çözümleriyle çalışırken daima eldiven giyin. AO'nun tartılması ve stok çözeltilerinin hazırlanması kimyasal davlumbaz altında yapılmalıdır.</li>
	<li>Hedef dışındaki tüm tahlil bileşenlerini içeren ana karışımı hazırlayın. Numune hacmini (60 μL) numune sayısı artı bir (n+1) ile çarparak ana karışım hacmini (Vkarışımı) hesaplayın: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68483/68483eq01.jpg" style="margin: auto;"> Numune sayısı n, gerekli negatif ve pozitif kontrolleri içermelidir.</li>
	<li>0.25x Vkarışımı μL 4x Tahlil Tamponu, 0.1x Vkarışımı μL 0.1 mM AO, 0.1x Vkarışımı μL 10 μM SLAS-S ve 0.1x Vkarışımı μL 10 μM SLAS-S'yi birleştirin. Adım 3.4'te <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68483/68483eq02.jpg" style="margin: auto;"> eklenen hedef hacmi barındıracak şekilde son hacmine nükleaz içermeyen su ekleyin. Ana karışımı girdap haline getirin ve kısaca santrifüjleyin. Ana karışımın 50 μL'sini n numune tüpüne ekleyin. NOT: Numune hacmi, floresan sinyalini algılamak için kullanılan cihazın özelliklerine bağlı olarak ayarlanabilir. Numune tüplerine aktarılan ana karışımın hacmi, adım 3.4'te eklenen hedef hacme göre ayarlanabilir. Ana karışımı yapmak için eklenen nükleaz içermeyen su hacmi buna göre ayarlanmalıdır. Örneğin, hedef içeren numune, nihai numune hacminin 'unda (V/V) eklenirse, ana karışıma 0,9x Vkarışıma kadar su eklenmelidir.</li>
	<li>Bir örneği hedefsiz kontrol (boş) ve bir örneği pozitif kontrol olarak kullanın. 10-1000 nM hedef içeren 60 μL'lik nihai numune hacmini elde etmek için ana karışıma (50 μL) 10 μL hedef içeren numune ekleyin. Boşluk için hedef yerine nükleaz içermeyen su (10 μL) kullanın. Pozitif kontrol için, hedeflenen diziyi içeren sentetik bir DNA oligonükleotidi kullanın (örneğin, hedef M, Tablo 1). 0.1-0.5 μM nihai konsantrasyon yapmak için 10 μL 0.6-3 μM kontrol ekleyin. NOT: Bu pozitif kontroldeki yüksek floresan, test edilen bilinmeyen numuneler için negatif bir sinyal gözlense bile testin beklendiği gibi çalışmasını sağlar.</li>
	<li>Numuneleri karıştırın ve bir mikrosantrifüj kullanarak döndürün. Numuneleri 22 °C'de 10-60 dakika inkübe edin. Sinyal, 40 dakika ile 60 dakika arasında yalnızca %&lt;15 oranında artar (Şekil 3).</li>
	<li>Bir floresan spektrofotometre kullanarak 475 nm'de uyarma üzerine numunelerin floresansını 540 nm'de ölçün. NOT: İnce duvarlı PCR tüplerinde floresanı ölçen portatif bir florometre kullanmak mümkündür. Florometrenin, AO floresansını tespit etmek için uygun uyarma ve emisyon filtrelerine sahip olması gerekir. Uygun bir uyarma filtresine bir örnek, 495 nm'lik bir kısa geçiştir. Uygun bir emisyon filtresi örneği 510-580 nm'dir. Alternatif olarak, numunedeki AO floresansının bir UV veya Mavi ışık kaynağı ile uyarılması üzerine sinyal görsel olarak gözlemlenebilir. DİKKAT: UV lambası kullanılıyorsa, UV koruyucu gözlük takın.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig3.jpg"> 
Şekil 3: SLAS-29U/30S için sinyal üretiminin zamana bağımlılığı. AO, SLAS-29U ve SLAS-30S içeren bir numune, 60 dakika boyunca bir floresan spektrofotometrenin kinetik modu (475 nm'de uyarma, 540 nm'de emisyon, 5 nm uyarma/emisyon yarıkları) kullanılarak analiz edildi. 5 dakikalık bir sürede (bir okla gösterilir), numuneye hedef M eklendi. Verilerin ortalaması iki bağımsız denemeden alınmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<ol><li>Wetmur, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Probes%3A+Applications+of+the+principles+of+nucleic+acid+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA Probes: Applications of the principles of nucleic acid hybridization.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 26 (3-4), 227-259 (1991).</li>
<li>Tyagi, S., Kramer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Beacons%3A+Probes+that+Fluoresce+upon+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization.</a> Nat Biotechnol. 14, 303-308 (1996).</li>
<li>Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elegant+biosensor+molecular+beacon+probe%3A+challenges+and+recent+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica%22%5BJournal%5D)">An elegant biosensor molecular beacon probe: challenges and recent solutions.</a> Scientifica. 2012, 928783(2012).</li>
<li>Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+binary+DNA+probe+for+highly+specific+nucleic+acid+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">A binary DNA probe for highly specific nucleic acid recognition.</a> J Am Chem Soc. 128 (32), 10625-10628 (2006).</li>
<li>Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+probes+for+nucleic+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Binary probes for nucleic acid analysis.</a> Chem Rev. 110 (8), 4709-4723 (2010).</li>
<li>Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequilibrium+hybridization+enables+discrimination+of+a+point+mutation+within+5-40+C%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C.</a> J Am Chem Soc. 138 (41), 13465-13468 (2016).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bacterial+16S+rRNA+using+a+molecular+beacon-based+X+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor.</a> Biosens Bioelectron. 41, 386-390 (2013).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Hayson, A., Ballantyne, J., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+molecular+beacon+probe+is+sufficient+for+the+analysis+of+multiple+nucleic+acid+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">A single molecular beacon probe is sufficient for the analysis of multiple nucleic acid sequences.</a> Chembiochem. 11 (12), 1762-1768 (2010).</li>
<li>Gao, T., Luo, Y., Cao, Y., Pei, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+isolation+of+aptamers+to+light-up+the+dyes+and+the+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Progress in the isolation of aptamers to light-up the dyes and the applications.</a> Analyst. 145, 701-718 (2020).</li>
<li>Du, Y., Li, B., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BFitting%26%2334%3B+makes+%26%2334%3Bsensing%26%2334%3B+simple%3A+Label-free+detection+strategies+based+on+nucleic+acid+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">&#34;Fitting&#34; makes &#34;sensing&#34; simple: Label-free detection strategies based on nucleic acid aptamers.</a> Acc Chem Res. 46 (2), 203-213 (2013).</li>
<li>Kolpashchikov, D. M., Spelkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+%28split%29+light-up+aptameric+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Binary (split) light-up aptameric sensors.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 60 (10), 4988-4999 (2021).</li>
<li>Kato, T., Shimada, I., Kimura, R., Hyuga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-up+fluorophore--DNA+aptamer+pair+for+label-free+turn-on+aptamer+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Light-up fluorophore--DNA aptamer pair for label-free turn-on aptamer sensors.</a> Chem Commun. 52 (21), 4041-4044 (2016).</li>
<li>Connelly, R. P., Madalozzo, P. F., Mordeson, J. E., Pratt, A. D., Gerasimova, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+dye+binding+by+a+light-up+aptamer%3A+Application+for+label-free+multi-wavelength+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Promiscuous dye binding by a light-up aptamer: Application for label-free multi-wavelength biosensing.</a> Chem Commun. 57 (30), 3672-3675 (2021).</li>
<li>Kikuchi, N., Reed, A., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+dapoxyl+aptamer+for+sequence-selective+analysis+of+nucleic+acid+sequence+based+amplification+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Split dapoxyl aptamer for sequence-selective analysis of nucleic acid sequence based amplification amplicons.</a> Anal Chem. 91 (4), 2667-2671 (2019).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+detection+in+biologically+relevant+media+using+a+split+aptamer+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">MicroRNA detection in biologically relevant media using a split aptamer platform.</a> Bioorg Med Chem. 69, 116909(2022).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Nedorezova, D. D., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+light+up+aptamers+as+a+probing+tool+for+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Split light up aptamers as a probing tool for nucleic acids.</a> Methods. 197, 82-88 (2021).</li>
<li>Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinase+polymerase+amplification+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications.</a> Clin Chem. 62, 947-958 (2016).</li>
<li>Compton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+sequence-based+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid sequence-based amplification.</a> Nature. 350, 91-92 (1991).</li>
<li>Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfold+web+server+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.</a> Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415 (2003).</li>
<li>Pierce, K. E., Sanchez, J. A., Rice, J. E., Wangh, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear-after-the-exponential+%28LATE%29-PCR%3A+primer+design+criteria+for+high+yields+of+specific+single-stranded+DNA+and+improved+real-time+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Linear-after-the-exponential (LATE)-PCR: primer design criteria for high yields of specific single-stranded DNA and improved real-time detection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8609-8614 (2005).</li>
<li>Grochans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+glioblastoma+multiforme-Literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of glioblastoma multiforme-Literature review.</a> Cancers. 14, 2412(2022).</li>
<li>Vaidya, M., Bacchus, M., Sugaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+sequences+of+exosomal+NANOG+DNA+as+a+potential+diagnostic+cancer+marker%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential sequences of exosomal NANOG DNA as a potential diagnostic cancer marker.</a> PLoS One. 13, e0197782(2018).</li>
<li>Owczarzy, R., Moreira, B. G., You, Y., Behlke, M. A., Walder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+stability+of+DNA+duplexes+in+solutions+containing+magnesium+and+monovalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations.</a> Biochemistry. 47, 5336-5353 (2008).</li>
<li>Bhattacharyya, D., Arachchilage, G. M., Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+cations+in+G-quadruplex+folding+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Metal cations in G-quadruplex folding and stability.</a> Front Chem. 4, 2296-2646 (2016).</li>
<li>Chen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+of+free+and+protein-bound+auramine+O%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fluorescence of free and protein-bound auramine O.</a> Arch Biochem Biophys. 179 (2), 672-681 (1977).</li>
<li>Klymchenko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvatochromic+and+fluorogenic+dyes+as+environment-sensitive+probes%3A+Design+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Solvatochromic and fluorogenic dyes as environment-sensitive probes: Design and biological applications.</a> Acc Chem Res. 50 (2), 366-375 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Auramin O</td><td>MP Biomedicals&nbsp;</td><td>195064</td><td>sinyal raporlaması için kullanılan florojenik bir boya</td></tr><tr><td>Cary Eclipse Florometre</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>G9800A Serisi</td><td>numunelerin floresan sinyalini ölçmek için</td></tr><tr><td>Dimethy Sülfoksit</td><td>MP Biomedicals&nbsp;</td><td>196055</td><td>Auramine O'nun stok çözeltilerini hazırlamak için çözücü</td></tr><tr><td>DNA oligonükleotitleri (primerler, SLAS iplikleri, PCR için sentetik şablon)</td><td>IDT</td><td>YOK</td><td>satıcı tarafından özel olarak yapılmış ve tuzdan arındırılmış, daha fazla saflaştırma yapılmadan kullanılmış</td></tr><tr><td>dNTP karışımı, 10 mM</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>R0191</td><td>GEÇ PCR reaksiyonu için</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td>tampon bileşeni; probun ipliklerinin analiz edilen hedefle doğru ilişkisi için gereklidir</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri (1,5 mL)</td><td>Balıkçı markası</td><td>02-681-320</td><td>Numune hazırlama için plastik</td></tr><tr><td>Mikropipet (0.1-2.5 &mikro; L)</td><td>Eppendorph</td><td>K56877G</td><td>Numune hazırlama için kullanılır</td></tr><tr><td>Mikropipet (100-1000 &mikro; L)</td><td>Eppendorph</td><td>K13160F</td><td>Numune hazırlama için kullanılır</td></tr><tr><td>Mikropipet (20-200 &mikro; L)</td><td>Eppendorph</td><td>J05253M</td><td>Numune hazırlama için kullanılır</td></tr><tr><td>Mikropipet (2-20 &mikro; L)</td><td>Eppendorph</td><td>G24675G</td><td>Numune hazırlama için kullanılır</td></tr><tr><td>Mini Santrifüj</td><td>Corning&nbsp;</td><td>6770</td><td>örnekleri döndürmek için kullanılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Nükleaz İçermeyen Su (DEPC ile İşlenmemiş)</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>AM9932</td><td>PCR ve SLAS testindeki numuneler için kullanın</td></tr><tr><td>PCR tüpleri (0,5 mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9932</td><td>Quantus florometre kullanarak floresansı ölçmek için</td></tr><tr><td>Pipett uçları (20-200 &mikro; L)</td><td>VWR</td><td>76322-150</td><td>Numune hazırlama için plastik</td></tr><tr><td>Pipet uçları (1-10 uL)</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td>Numune hazırlama için plastik</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür&nbsp;</td><td>Davetli</td><td>AM9640G</td><td>tampon bileşeni; probun floresan ışıklı aptamer alanının doğru katlanması için gereklidir</td></tr><tr><td>Quantus Florometre</td><td>Promega</td><td>E6150 Serisi</td><td>Floresan ölçümleri için kullanılabilen taşınabilir düşük maliyetli florometre</td></tr><tr><td>Kuvars küvet</td><td>Yıldız</td><td>16.50F-Q-10/Z15</td><td>Cary Eclipse florometre kullanılarak floresan ölçümü için kullanılacak</td></tr><tr><td>Standart Taq Tamponlu Taq DNA Polimeraz</td><td>New England Biyo Laboratuvarları</td><td>M0273S</td><td>SLAS tahlili ile analiz edilecek bir gen parçasının amplifikasyonu için&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris-HCl tamponu (pH 7.4)</td><td>Boston Biyoürünleri</td><td>R-314 Serisi</td><td>tampon bileşeni</td></tr><tr><td>UV lambası</td><td>UVP'nin</td><td>95-0016-14</td><td>görsel sinyal gözlemi için AO'yu uyarmak için</td></tr><tr><td>Vorteks Karıştırıcı</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td>numuneleri karıştırmak için kullanılır</td></tr></tbody></table>

diziye Özgü nükleik asit analizi için sinyal raportörü olarak dna floresan işıklı aptamer kullanan bölünmüş hibridizasyon probu

Split Hybridization Probe Utilizing a DNA Fluorescent Light-up Aptamer as a Signal Reporter for Sequence-Specific Nucleic Acid Analysis

Sinyal muhabiri olarak DAP-10-42 çekirdeğini kullanan SLAS'ın performansı, agresif bir beyin kanseri formu olan glioblastoma multiforme'nin (GBM) ilerlemesi için önemli olan NANOGP8 genin bir parçasını sorgulamak için tasarlanmış bir prob kullanılarak gösterildi21. Bu parçanın, kanser hücrelerinden türetilen eksozomların DNA kargosunda SNS'ler içerdiği bildirildi22. Bu nedenle, SLAS, genin SNS bölgesine göre uyarlandı. Bu protokoldeki SLAS performansını göstermek i...

Diziye Özgü Nükleik Asit Analizi için Sinyal Raportörü Olarak DNA Floresan Işıklı Aptamer Kullanan Bölünmüş Hibridizasyon Probu

DNA-based fluorescent light-up aptamers (FLAPs) are promising for bioanalytical assays because they provide a low-cost fluorescent signal readout without ...

split-hybridization-probe-utilizing-dna-fluorescent-light-up-aptamer

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

DsDNA ölçümü Moleküler Problar PicoGreen boya ve bir mikroplak okuyucu aksesuar ile donatılmış Hitachi F-7000 Floresans Spektrofotometre kullanılarak gösterilmesi.

Hitachi F-7000 Floresans Spektrofotometre ve PicoGreen Boya kullanarak dsDNA Niceleme

Bu videoda, MCPyV viryonları ile enfekte olmuş hücreler, MCPyV'ye özgü genomları tespit etmek için in situ hibridizasyon zincir reaksiyonuna tabi tutuldu. Ayrıca, DNA-HCR tekniği, enfekte insan derisi hücrelerinde MCPyV DNA'sını görselleştirmek için FISH ile birleştirildi.

HCR-DNA FISH: Enfekte Hücrelerde Viral DNA'yı Tespit Etmek için Bir Floresan In Situ Hibridizasyon Tekniği

Bu videoda, mRNA problarının belirli hedef mRNA'ya hibritleştirilmesini içeren sıralı bir hibridizasyon stratejisi açıklanmaktadır. Prob hibridizasyonunu takiben, histolojik numunelerin RNA-CISH sırasında sinyal-gürültü oranının azaltılması yoluyla çözünürlüğü artırmak için sinyal amplifikasyonu gerçekleştirilir.

RNA In Situ Hibridizasyonda Prob Hibridizasyonu ve Sinyal Amplifikasyonu: Doku Kesitlerinde Spesifik RNA Dizilerini Tespit Etmek İçin Bir Teknik

Biz doğrudan etiketli floresan problar kullanarak 3D DNA FISH ile nükleer mimarisi analiz için sağlam ve çok yönlü protokol açıklar.

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

Burada, slayta monte kromozomlar üzerinde tekrarlayan heterokromatik dizileri görselleştirmek için floresan DNA in situ hibridizasyon (DNA ISH) gerçekleştirmek için basit bir yöntem sunuyoruz. Yöntem minimal reaktifler gerektirir ve kısa veya uzun problarla, farklı dokularla kullanım ve floresan veya floresan bazlı olmayan sinyallerle algılama için çok yönlüdür.

Floresan DNA için Basit Bir Yöntem<em&gt; In Situ</em&gt; Ezilmiş Kromozomlar için Hibridizasyon

Fotostabil siyanin boyaları, enerji transferi ile hibridizasyonun izlenmesi için oligonükleotidlere bağlanır.

Işığa siyanin boyası kullanarak Dalgaboyu değiştiren DNA Hibridizasyon Sondalar Sentezi

Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

DNAzyme tabanlı nanomakineler, nükleik asitlerin son derece seçici ve hassas tespiti için kullanılabilir. Bu makale, özgür yazılım kullanılarak 10-23 çekirdekli DNAzyme tabanlı nanomakinelerin tasarımı için ayrıntılı bir protokolü ve örnek olarak bir Epstein-Barr virüs parçasının tespitinde uygulanmasını açıklamaktadır.

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

Burada, ligaz, nükleaz ve polimeraz enzimlerinin örnekleri kullanılarak nükleik asit metabolize edici enzimlerin tahlili için bir protokol sunulmaktadır. Test, enzim davranışının karakterizasyonuna izin veren, RNA ve/veya DNA hasarlarını veya yol ara ürünlerini taklit eden dupleksler oluşturmak için birleştirilebilen floresan etiketli ve etiketsiz oligonükleotidleri kullanır.

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Nükleik asitler, biyolojik sistemleri değerlendirmek için yaygın analitlerdir; ancak, enzimatik manipülasyondan kaynaklanan yanlılık endişeye neden olabilir. Burada, polianilin kullanılarak nükleik asitlerin etiketsiz tespiti için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu hassas, uygun maliyetli sensör teknolojisi, moleküller arasındaki tek nükleotid farklılıklarını ayırt edebilir.

Nükleik Asitlerin bir Polyaniline tabanlı sensör

Öğrenin, DAP-10-42 floresan aptameri kullanan bölünmüş hibridizasyon probları ile tek nükleotid değişimlerini hassas şekilde tespit etme yöntemini. Bu etiketsiz analiz, nükleik asit hedeflerinin güvenilir şekilde ayırt edilmesini sağlar.

Diziye Özgü Nükleik Asit Analizi için Sinyal Raportörü Olarak DNA Floresan Işıklı Aptamer Kullanan Bölünmüş Hibridizasyon Probu

Daha fazla video keşfet