Diziye Özgü Nükleik Asit Analizi için Sinyal Raportörü Olarak DNA Floresan Işıklı Aptamer Kullanan Bölünmüş Hibridizasyon Probu
8 Temmuz 2025
Bu protokol, bir sinyal raportörü olarak floresan ışıklı aptamer DAP-10-42 kullanan bölünmüş hibridizasyon problarının tasarımını ve bunların nükleik asit tespiti ve tek nükleotid ikameleri ile hedefler arasında farklılaşma için uygulamalarını ana hatlarıyla belirtir.
Diziye özgü nükleik asit analizi için yeni tip floresan hibridizasyon probları geliştiriyoruz. Son zamanlarda, hibridizasyon analiz araçları, CRISPR-Cas sistemlerinden yararlanan tahlillerle genişledi. Şu anda, TaqMan gibi son teknoloji hibridizasyon probları ve moleküler işaret probları, nükleik asit hedeflerini analiz etmek için en çok kullanılmaktadır.
Tek nükleotid ikamelerinin ve nükleik asit hedeflerinin doğru tespiti hala pratik olarak zordur. Protokolümüz, etiketsiz bir floresan sinyali okuması sağlarken gerekli hücre aktivitesi seviyesini sağlar. Başlamak için, SLAS'ı oluşturan iki değiştirilmemiş DNA oligonükleotit zincirinin dizilerini tasarlayın.
DAP-10-42'nin 6 ila 39'u için nükleotid içeren bir fragman kullanın. 1 ila 8 ve 36 ila 42 nükleotidlerinden oluşan gövde 1'i, 5. pozisyonda şişkin bir timini çıkararak, gövdeyi dört baz çiftine kısaltarak ve bir terminal sitozin-guanin baz çifti ekleyerek gövde 1 asalına dönüştürün. Bir SLAS zincirine 9 ila 29 nükleotidleri ve diğerine 30 ila 35 nükleotidleri dahil edin.
Deoksi GGTCAT ekleyerek parçanın üç asal terminal dizisini 9 ila 29 nükleotidleri ile uzatın. Daha sonra, altı bazlı bir çift gövde 2 oluşturmak için 30 ila 35 fragmanın beş asal terminal dizisini deoksi TGACC ile uzatın. Şimdi deoksi TT bağlayıcıları ve nükleik asit hedefini tamamlayıcı DNA dizileri ile her iki iplikçikte gövde 1 asal uzatın.
Bu, probu oluşturan SLAS-U ve SLAS-S ipliklerinin dizilerini verir. SLAS-S'yi 7 ila 10 nükleotid bölgesine tamamlayıcı yapın. Bu, tek nükleotid ikame bölgesini içerir.
Ardından, SLAS-U'nun hedef bağlanma kolunun, SLAS-S bölgesine bitişik 15 ila 25 nükleotid fragmanına tamamlayıcı olduğundan emin olun. UNAFold web sunucusunu kullanarak hedef bağlama dublekslerinin erime sıcaklıklarını değerlendirin. INAMelt sekmesine tıklayın.
Uygulamalar'a gidin ve İki Durumlu Erime Hibridizasyonu'nu seçin. Etkileşen dizileri sol ve sağ kutulara beş asal ila üç asal sırada girin. Daha sonra tahlil sıcaklığını 22 santigrat dereceye ayarlayın ve tek değerlikli ve iki değerlikli katyon konsantrasyonlarını sırasıyla 20 milimolar ve 25 milimolar iyonlara girin.
İlgili kutuda etkileşen dizilerin konsantrasyonlarını ayarlayın. Gönder'e basın ve ilgili dubleksler için Gibbs enerji değişimi, entalpY, entropi ve erime sıcaklığı değerlerini inceleyin. Mükemmel eşleşen hedefler için erime sıcaklıklarının ve SLAS-S ve SLAS-U'nun hedef bağlama kollarının test sıcaklığının, 22 santigrat derecenin üzerinde olduğunu doğrulayın.
Özgüllüğü korumak için SLAS-S ile uyumsuz bir hedef arasındaki dubleksin, tahlil sıcaklığının altında erime sıcaklıkları verdiğinden emin olun. Gerekirse, hedef bağlama kollarının uzunluklarını bu koşulları karşılayacak şekilde ayarlayın. Nihai SLAS-U ve SLAS-S oligonükleotit zincirlerini ticari bir DNA tedarikçisinden alın veya otomatik bir DNA sentezleyici kullanarak bunları şirket içinde sentezleyin.
Auramine O, SLAS-S, SLAS-U ve tahlil tamponunun stok çözeltilerini hazırlayın. Hedef dışındaki tüm tahlil bileşenlerini içeren ana karışımı hazırlayın. Ana karışımın son beşe altıncı hacmine nükleaz içermeyen su ekleyin.
Ardından ana karışımı vorteksleyin ve döndürün. Her numune tüpüne 50 mikrolitre dağıtın. Ardından, bir örneği hedef olmayan boşluk ve diğerini pozitif kontrol olarak etiketleyin.
60 mikrolitrelik bir numune yapmak için ana karışımı içeren bir tüpe 10 mikrolitre hedef içeren numune ekleyin. Boşluk için 10 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Daha sonra hedef diziyi içeren 10 mikrolitre sentetik DNA oligonükleotidi pozitif kontrol tüpüne pipetleyin.
Tüm numuneleri bir mikrosantrifüj kullanarak santrifüjde kısaca karıştırın. Ardından tüpleri 22 santigrat derecede 10 ila 60 dakika inkübe edin. Bir floresan spektrofotometre kullanarak 475 nanometrede uyarıldığında floresansı 540 nanometrede ölçün.
SLAS, NANOGP8 geninin belirli bir parçasını hedef alacak şekilde uyarlanmıştır. Hedef M, SLAS-S zincirini tamamen tamamlayıcıydı, hedef MM ise SLAS-S ile bir uyumsuzluk ortaya çıkaran bir sitozin nükleotid pozisyonu 1, 423'e sahipti. Tamamen tamamlayıcı hedef M'nin eklenmesi üzerine, floresan istikrarlı bir şekilde arttı ve 45 ila 50 dakika sonra plato yaptı.
Bununla birlikte, 10 SLAS'lık bir sinyal-boşluk oranıyla 10 dakika içinde net bir sinyal tespit edilebildi, tam olarak eşleşen hedefler için yüksek floresan sinyali gösterdi, ancak eşleşmeyen hedefler veya boşluklar için değil. Floresan çıkışı, 500 nanomolara kadar hedef konsantrasyonla doğrusal olarak arttı, bu da ölçüm limitlerinin ölçülmesini ve belirlenmesini sağladı. PCR ile güçlendirilmiş numuneler, yalnızca Numune 2'nin floresan eşik değeri olan 2'yi aşmasıyla değişen seviyelerde sinyal gösterdi.
Kalibrasyon eğrisine dayanarak, Örnek 2'deki NANOGP8 amplikon konsantrasyonunun 124+ veya 13 nanomolar olduğu tahmin edilmiştir. SLAS sinyalinin floresan tespiti, hem tezgah üstü spektrofotometrede hem de taşınabilir bir florometrede tutarlıydı. UV ışığı kullanılarak 20'nin üzerinde bir sinyal-boşluk oranı da görsel olarak gözlemlendi.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, sinyal raporlayıcı olarak DAP-10-42 kullanımına odaklanarak, spesifik nükleik asit analizi için floresan hibridizasyon problarının geliştirilmesini açıklamaktadır. Protokol, tek nükleotid değişimlerinin tespit edilmesindeki zorlukları ele almaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Floresan hibridizasyon probları
- Nükleik asit tespiti
- Tek nükleotid substitüsyonları
Arkaplan
- Güncel hibridizasyon analiz araçları arasında TaqMan ve moleküler beacon probları yer almaktadır.
- Nükleik asit hedeflerinin doğru şekilde tespit edilmesi zorlayıcı olmaya devam etmektedir.
- CRISPR-Cas sistemleri, hibridizasyon analiz yeteneklerini genişletmiştir.
- Etkili analiz için etiketsiz floresan sinyal okumaları gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Nükleik asit tespitini geliştirmek için bölünmüş hibridizasyon probları tasarlamak.
- Tek nükleotid değişimine sahip hedefleri birbirinden ayırt etmek.
- Doğru floresan sinyaller sağlarken hücre aktivitesini korumak.
Kullanılan Yöntemler
- Modifiye edilmemiş iki DNA oligonükleotid dizisinin tasarımı.
- Floresan ışık veren aptamer DAP-10-42'nin kullanımı.
- Nükleik asit analizinde bölünmüş hibridizasyon problarının uygulaması.
- Sinyal okuma verimliliğinin değerlendirilmesi.
Temel Sonuçlar
- Bölünmüş hibridizasyon problarının başarılı tasarımı.
- Nükleik asit hedeflerinin etkili şekilde ayırt edilmesi.
- Kanıtlanmış etiketsiz floresan sinyal okuması.
- Tek nükleotid değişimlerinin tespitinde artırılmış doğruluk.
Sonuçlar
- Geliştirilen problar nükleik asit saptama yeteneklerini artırmaktadır.
- Tek nükleotid varyasyonlarının analizi için güvenilir bir yöntem sunarlar.
- Bu yaklaşım nükleik asit analizi alanını ileriye taşıyabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
DNA floresan ışık-açan aptamerler (FLAPs) ile bölünmüş hibridizasyon probları kullanılarak yapılan diziye özgü nükleik asit analizi, tek nükleotid değişimlerinin yüksek özgünlük ve kantitatif güvenilirlikle tespit edilmesiyle ilgili süregelen zorlukları gidermektedir. Bu yaklaşım; etiketsiz, maliyet etkin ve ölçeklenebilir floresan tabanlı okumalar sağlayarak, erken keşif ve tarama iş akışlarında güçlü hedef doğrulamayı ve mekanistik risk azaltmayı destekler. Yöntemin seçiciliği ve kantitatif çıktıları, biyofarma Ar-Ge'sindeki portföy önceliklendirme ve riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarıyla doğrudan ilgilidir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Yüksek seçicilikle tek nükleotit değişimlerini tespit ederek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Kantitatif, diziye özgü floresan çıktılar aracılığıyla fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Tam eşleşen nükleik asit hedeflerini, hatalı eşleşenlerden ayırarak mekanistik risk azaltma sürecini kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Alt akış tarama iş akışları için valide edilmiş, etiketsiz analiz sistemleri hazırlar.
- Analiz geliştirme için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir ve kantitatif floresans ölçümleri sağlar.
- Geleneksel veya el tipi floresans deteksiyon platformları kullanarak hızlı, ölçeklenebilir ve taşınabilir tarama hazırlığına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Klinik olarak ilgili tek nükleotit varyantlarının tespitine olanak tanıyarak translasyonel biyobelirteç hizalamasını destekler.
- Kantitatif, sekans spesifik çıktılarla, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
- Karmaşık örneklerde hedef varyantların kesin bir şekilde ayırt edilmesini sağlayarak biyolojik riski azaltır.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu bölünmüş hibridizasyon probu platformu, erken keşiften öncü bileşik belirlemeye ve preklinik araştırmalara kadar olan süreci entegre ederek hipotez testlerini, assay geliştirmeyi ve translasyonel biyobelirteç validasyonunu destekler.
- Keşif Biyolojisi: Diziye özgü nükleik asit tespitine olanak tanıyarak hipotez testlerini ve yolakların netleştirilmesini kolaylaştırır.
- Tarama: Güvenilir bileşik veya hedef değerlendirmesi için tekrarlanabilir, kantitatif floresan çıktıları sağlar.
- Analitikler: Ölçülebilir okumalar ve eşleşen ile eşleşmeyen hedefler arasında istatistiksel ayrım sunar.
- Translasyonel Araştırma: Hastalıkla ilişkili örneklerde tek nükleotid varyantlarının tespitini sağlayarak biyobelirteç odaklı çalışmalarla uyum sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli nükleik asit hedefleri ve iş akışlarına uyarlanabilir, yeniden kullanılabilir ve etiketsiz bir tespit kapasitesi sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tek nükleotid çözünürlüğü sağlayarak öngörü güvenini ve hedef doğrulamayı artırır.
- Operasyonel Değer: Etiketsiz, ölçeklenebilir saptama ile analiz iş akışlarını standartlaştırır ve basitleştirir.
- Stratejik Değer: Geç evre biyolojik riskleri azaltarak devam/durdur kararlarını ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Keşif ve preklinik programların riskle uyumlu önceliklendirilmesini ve ilerletilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Nükleik asit prob tasarımı ve erime sıcaklığı analizi konusunda uzmanlık gerektirir.
- Kantitatif okuma için floresan spektrofotometrelere veya taşınabilir florometrelere erişim gereklidir.
- Tekrarlanabilirlik için prob sentezinin ve assay koşullarının ekipler arası standardizasyonu gerekir.
- Komplementer diziler ve prob kolları özelleştirilerek çeşitli nükleik asit hedeflerine uyarlanabilir.
- Özgüllük, prob-hedef dubleks stabilitesinin ve assay sıcaklığının dikkatli optimizasyonuna bağlıdır.
