Canlı Etiketsiz Meme Kanseri Hücrelerinin Fenotiplemesini Geliştirmek için Multimodal Bir Görüntüleme Çerçevesi

Şimdi protokolümüz, insan meme kanseri hücrelerinin doğal fizyolojik ortamlarında hızlı ve tarafsız morfokimyasal fenotiplemesi için konfokal Raman mikrospektroskopisi ve tomografik faz mikroskobu kullanarak multimodal görüntüleme sunuyoruz. Raman mikrospektroskopisi ve tomografi faz mikroskobunun birleştirilmesi, fizyolojik koşullar altında etiketsiz görüntülemeye olanak tanır, hücreler hakkında biyokimyasal ve morfolojik bilgi sağlar ve floresan etiketleme veya kimyasal fiksasyon gibi geleneksel pertürbatif yöntemlerin sınırlamalarını giderir. Sonuçlarımız, meme kanseri hücrelerinin morfokimyasal fenotiplenmesini sağlamada multimodal yaklaşımın uygulanmasında yüksek bir potansiyel olduğunu göstermektedir. Üstelik çok yönlülüğü, tekrarlanabilirliği ve invaziv olmaması, temel hücre biyolojisi çalışmalarından teşhise kadar çok çeşitli biyomedikal uygulamalar için umut verici bir araç haline geldi.

Rejeneratif tıp ve hastalık araştırmalarını ilerletmek için non-invaziv embriyonik kalite kontrolü, hücresel yaşlanmanın tespiti ve organoid modellerde ilaç taraması için bir optik biyobelirteç atlası oluşturmayı hedefliyoruz.

[Eğitmen] Başlamak için, MDA-MB-231 insan meme kanseri hücre örneğini sahnedeki inkübatöre yerleştirin. Suya daldırma hedefi için su ekleyin. Objektif merceğine su sağlamak için otomatik suya daldırmalı besleyiciyi açın. Buharlaşmayı önlemek ve ölçümler boyunca tutarlı görüntüleme koşulları sağlamak için su seviyelerini düzenli olarak kontrol edin. Şimdi pompa lazerini açın ve numune düzleminde 75 miliwatt'lık bir lazer gücü elde etmek için çıkışını ayarlayın. Micro-Manager mikroskop kontrol yazılımını açın. Yapılandırma ayarlarında BF'yi seçin ve yazılım penceresinin sol tarafındaki canlı'ya tıklayın. İstediğiniz tek hücreyi seçin, ardından parlak alan görselleştirmesini sonlandırmak için durdur'u tıklatın. CCD kamera kontrol yazılımını açın. Deney ayarında, pozlama süresini 1,5 saniyeye ayarlayın. Deney araç çubuğunda çalıştır'a tıklayın ve lazer ışınını açın. Ardından, parmak izi bölgesindeki sinyal sayılarını 600 ila 1,800 ters santimetre arasında en üst düzeye çıkarmak için Z konumunu ayarlayın ve ardından lazeri kapatın. Deney araç çubuğunda durdur'a tıklayın ve yazılımdan çıkın. Çok boyutlu ölçümlerde Raman kanallarını otomatik olarak yöneten ve verileri kaydeden MATLAB scriptini kullanarak veri toplama sürecini başlatın. Görüş alanını, her piksel 1,25 x 1,25 mikrometre kareyi kaplayan 40 x 40 piksel çözünürlükte 50 x 50 mikrometre kareye ayarlayın. Her Raman spektrumu için pozlama süresini 1,5 saniyeye ayarlayın ve MATLAB komut dosyasını çalıştırın. Raman hiperspektral haritalarının sonradan işlenmesi için RamApp web tabanlı aracı başlatın. Analizlerim sekmesinde yeniye tıklayarak hiperspektral verileri içe aktarın ve X ekseni değişkeniyle birlikte uzamsal ve spektral veri değişkenlerini içeren .mat dosyasını yükleyin. Spektrumu kesmek için kırpma ve döndürme menüsünde spektral kırpmayı seçin. Raman kayma bölgesinin alt ve üst sınırlarını sırasıyla 600 ve 1.800 ters santimetre olarak tanımlayın. Kozmik ışınları düzeltmek için gürültü gidermeye gidin, spike gidermeye tıklayın, yöntem olarak Z-skorunu seçin ve eşiği sekiz olarak ayarlayın. Seçenekleri işaretleyin ilk farkı kullan ve ani artışları düzeltin, ardından düzeltmeyi uygulamak için çalıştır'ı tıklayın. Haritalardaki paraziti kaldırmak için yumuşak harita'yı tıklayın, ortanca filtresini seçin, karenin büyüklüğünü üç piksel olarak ayarlayın, sonra çalıştır'ı tıklayın. Her pikselin spektrumunu yumuşatmak için Savistky-Golay filtresini seçin. Filtre penceresi uzunluğunu yedi ve polinom sırasını iki olarak ayarlayın, ardından çalıştır'a tıklayın. Ortalama arka plan sinyalini çıkarmak için optik alt tabaka kaldırma'yı açın ve alt tabakayı tanımla'yı tıklatın. İki kümeli yöntem olarak k-ortalamaları ayarlayın. Ardından Gelişmiş Seçenekler'e tıklayın. Ön plandaki küçük lekeleri kaldırmak için morfolojik temizlemeyi seçin ve ardından çalıştır'a tıklayın. Ortalama arka plan sinyalini kaldırmak için, alt tabakayı kaldır'a tıklayın, ardından genel ortalamayı veya merkezi değerlerin %95'i yönteminin ortalamasını seçin ve çalıştır'a tıklayın. Temel floresansı düzeltmek için taban çizgisi panelini açın, doğru taban çizgisine tıklayın, uyarlanabilir pürüzsüzlük PLS'yi seçin, ardından lambda'yı 5 milyona ayarlayın ve çalıştır'a tıklayın. Her Raman hiperspektral haritasının normalleştirilmesi için çeşitli'ye gidin, normalleştir'i seçin, Frobenius yöntemini seçin ve çalıştır'a tıklayın. Hücre altı dağılımı gösteren sahte renkli bir görüntü oluşturmak için, görüntüler panelinde, yoğunluk görüntüsü altındaki aç menü sembolüne tıklayın ve ardından görüntüyü düzenle'ye tıklayın. Düzenleme panelinde, tek bant'ı seçin ve spektral aralığı tanımlayın. Şimdi, renk haritasında çift rengi seçin, ardından onayla'ya tıklamadan önce rengi, yoğunluk eşiğini ve opaklığı tanımlayın. Tek nokta spektrumunu indirmek için ilgilendiğiniz pikseli seçin, ardından spektrum göstergesi panelinde spektrumu indir'e tıklayın. Son olarak, ön plan ve alt tabaka spektrumlarını dışa aktarmak için şuraya gidin: spektral açıklama, ardından hem ön plan hem de alt tabaka bölümleri için spektrumu indir'e tıklayın. Mikroskobun objektif merceğine bir damla damıtılmış su damlatın. Numuneyi mikroskobun öteleme aşamasına yerleştirin, ardından objektif merceği ile hizalamak için numune konumunu ayarlayın. Mikroskobu açın ve görüntüleme yazılımını başlatın. Araç çubuğundaki mikroskop simgesine tıklayın. Başlatmadan sonra, yapılandırma'ya tıklayın, iş panelinde canlı hücreyi ve ortam olarak PBS'yi seçin. Ardından, görüntüleme yazılımının kontrol panelindeki kalibrasyon sekmesine erişin. Sırasıyla odak ve yüzeyi seçerek objektif ve kondansatör lenslerin eksenel konumlarını ayarlayın. Şimdi, lensleri manuel olarak ayarlamak ve aydınlatma modellerinin ortalanmış ve neredeyse statik olduğundan emin olmak için tarama moduna tıklayın. Normal modu seçin, ardından hücreyi görüş alanına getirmek ve örneğe odaklanmak için çeviri aşamasını ayarlayın. Hücresiz bir bölgeyi bulmak için çeviri aşamasını ayarlayın. Farklı aydınlatma açılarında birden çok 2B hologram yakalamak için kalibre et'i seçin. Hücreyi ortalamak için çeviri aşamasını ayarlayın, ardından edinme sekmesine gidin ve hücrenin tomogramını yakalamak için 3B anlık görüntü'yü seçin. Holografik tomogramları görselleştirmek için veri gezinti panelinde verileri seçin, sağ tıklayın ve aç'a tıklayın. Veri yöneticisi panelinde, RI tomogramına tıklayın. Hacim görselleştirme panelinde RI'yi seçin ve RI tuvalinin içine dört dikdörtgen renkli kutu çizin. Her renk kutusu için RI aralığının minimum ve maksimum değerlerini ayarlayın, sonra her kutuyla bir opaklık ve renk ilişkilendirin. Tanımlanan RI aralıklarını ve renk kutularını saklamak için kaydet'i tıklatın. Hücre morfolojisinin nicel tanımlayıcılarını elde etmek için analiz arayüzünü kullanın. Segmentasyon panelinin altında manuel'i seçin, ardından RI eşiği olarak 1,3450'yi ayarlayın ve uygula'ya tıklayın. Hesaplanan morfolojik indeksleri kaydetmek için kaydet'e tıklayın. Raman spektral haritalaması, bireysel MDA-MB-231 hücreleri içindeki sitoplazma, çekirdek, fenilalanin ve lipitlerin uzamsal dağılımını ortaya çıkardı. Sitoplazma, çekirdek, fenilalanin ve lipidlere karşılık gelen farklı Raman spektral tepe noktaları, parmak izi bölgesinde 600 ila 1.800 ters santimetre arasında doğrulandı. Tek hücrelerin kırılma indisi ısı haritaları, eksenel XY düzlemi, sagital YZ düzlemi ve koronal XZ düzlemlerinde hücre altı bileşenlerin iç dağılımını ortaya çıkardı. 3D tomografik rekonstrüksiyon, iç altyapılara karşılık gelen hacimsel kırılma indisi bölgelerini tanımladı. Tek bir MDA-MB-231 hücresinin kantitatif morfolojik ölçümleri, toplam hacmi 4024.189 mikrometreküp ve yüzey alanı 2383.707 mikrometre kare ve ortalama kırılma indisi 1.356 olan hücre morfolojisinin farklı tanımlayıcılarını gösterdi.