Name: İn vivo Paramecium tetraureliada Protein Etkileşim Çalışmaları için Yakınlık Biyotinilasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Öğrenin Paramecium tetraurelia'da protein etkileşimlerini in vivo yakınlık biyotinilasyonu ile nasıl çalışılır. Bu yöntem turboID ligaz kullanarak hızlı adaptasyon ve evre-spesifik biyotin etiketleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Stefanov, B. -A., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+mechanisms+of+eukaryotic+RNA-guided+programmed+DNA+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Functions and mechanisms of eukaryotic RNA-guided programmed DNA elimination.</a> Biochem Soc Trans. 53 (2), 473-485 (2025).</li>
<li>Swart, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+genetic+and+epigenetic+control+of+programmed+DNA+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of genetic and epigenetic control of programmed DNA deletion.</a> Nucleic Acids Res. 42 (14), 8970-8983 (2014).</li>
<li>Witzany, G. The Roles of transposable elements in transgenerational inheritance and genome evolution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStefanov%2C+B-A+%22Epigenetics+in+Biological+Communication.+Witzany%2C+G%22">Epigenetics in Biological Communication. Witzany, G</a>. , Springer Cham. 369-385 (2024).</li>
<li>Dubois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+invasion+of+the+paramecium+germline+genome+countered+by+a+domesticated+piggybac+transposase+and+the+NHEJ+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transposon invasion of the paramecium germline genome countered by a domesticated piggybac transposase and the NHEJ pathway.</a> Int J Evol Biol. 2012, 436196(2012).</li>
<li>Gruchota, J., Denby Wilkes, C., Arnaiz, O., Sperling, L., Nowak, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meiosis-specific+Spt5+homolog+involved+in+non-coding+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A meiosis-specific Spt5 homolog involved in non-coding transcription.</a> Nucleic Acids Res. 45 (8), 4722-4732 (2017).</li>
<li>Sandoval, P. Y., Swart, E. C., Arambasic, M., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversification+of+Dicer-like+proteins+and+small+RNAs+required+for+genome+sculpting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional diversification of Dicer-like proteins and small RNAs required for genome sculpting.</a> Dev Cell. 28 (2), 174-188 (2014).</li>
<li>Furrer, D. I., Swart, E. C., Kraft, M. F., Sandoval, P. Y., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+sets+of+piwi+proteins+are+involved+in+distinct+sRNA+pathways+leading+to+elimination+of+germline-specific+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Two sets of piwi proteins are involved in distinct sRNA pathways leading to elimination of germline-specific DNA.</a> Cell Rep. 20 (2), 505-520 (2017).</li>
<li>Lepère, G., Bétermier, M., Meyer, E., Duharcourt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+noncoding+transcripts+antagonize+the+targeting+of+DNA+elimination+by+scanRNAs+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Maternal noncoding transcripts antagonize the targeting of DNA elimination by scanRNAs in Paramecium tetraurelia.</a> Genes Dev. 22 (11), 1501-1512 (2008).</li>
<li>Garnier, O., Serrano, V., Duharcourt, S., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+programming+of+developmental+genome+rearrangements+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated programming of developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia.</a> Mol Cell Biol. 24 (17), 7370-7379 (2004).</li>
<li>Khanduja, J. S., Calvo, I. A., Joh, R. I., Hill, I. T., Motamedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+noncoding+RNAs+and+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear noncoding RNAs and genome stability.</a> Mol Cell. 63 (1), 7-20 (2016).</li>
<li>Yao, M. -C., Chao, J. -L., Cheng, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+genome+rearrangements+in+Tetrahymena%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Programmed genome rearrangements in Tetrahymena.</a> Microbiol Spectr. 2 (6), (2014).</li>
<li>Nowacki, M., Zagorski-Ostoja, W., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nowa1p+and+Nowa2p%3A+Novel+putative+RNA+binding+proteins+involved+in+trans-nuclear+crosstalk+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nowa1p and Nowa2p: Novel putative RNA binding proteins involved in trans-nuclear crosstalk in Paramecium tetraurelia.</a> Curr Biol. 15 (18), 1616-1628 (2005).</li>
<li>Drews, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+piwis+with+Ago-like+functions+silence+somatic+genes+at+the+chromatin+level%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Two piwis with Ago-like functions silence somatic genes at the chromatin level.</a> RNA Biol. 18 (sup2), 757-769 (2021).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISWI1+complex+proteins+facilitate+developmental+genome+editing+in+Paramecium%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ISWI1 complex proteins facilitate developmental genome editing in Paramecium.</a> Genome Res. 35 (1), 93-108 (2025).</li>
<li>Bernier, S. C., Cantin, L., Salesse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+the+expression%2C+solubility%2C+and+purification+of+a+passenger+protein+in+fusion+with+different+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of the expression, solubility, and purification of a passenger protein in fusion with different tags.</a> Protein Expr Purif. 152, 92-106 (2018).</li>
<li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).</li>
<li>Beisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+clonal+Paramecium+tetraurelia+cell+lines+of+controlled+age+through+daily+reisolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Maintaining clonal Paramecium tetraurelia cell lines of controlled age through daily reisolation.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (1), pdb.prot5361(2010).</li>
<li>Berger, J. D., Rahemtullah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+to+autogamy+in+Paramecium+blocks+mating+reactivity%3A+implications+for+regulation+of+the+sexual+pathway+and+the+breeding+system%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Commitment to autogamy in Paramecium blocks mating reactivity: implications for regulation of the sexual pathway and the breeding system.</a> Exp Cell Res. 187 (1), 126-133 (1990).</li>
<li>Stefanov, B. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+protein+thermometer+enables+precise+electrothermal+control+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded protein thermometer enables precise electrothermal control of transgene expression.</a> Adv Sci (Weinh). 8 (21), e2101813(2021).</li>
<li>Shin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+proximity+labeling+with+enhanced+direct+identification+of+biotinylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution proximity labeling with enhanced direct identification of biotinylation sites.</a> Commun Biol. 7 (1), 554(2024).</li>
<li>Leffers, K. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+natural+and+recombinant+prion+protein+into+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly of natural and recombinant prion protein into fibrils.</a> Biol Chem. 386 (6), 569-580 (2005).</li>
<li>Stefanov, B. -A., Ajuh, E., Allen, S., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+release+factor+1+from+Euplotes+promotes+frameshifting+at+premature+stop+codons+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic release factor 1 from Euplotes promotes frameshifting at premature stop codons in human cells.</a> iScience. 27 (4), 109413(2024).</li>
<li>Stefanov, B. -A., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarker-driven+feedback+control+of+synthetic+biology+systems+for+next-generation+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biomarker-driven feedback control of synthetic biology systems for next-generation personalized medicine.</a> Front Bioeng Biotechnol. 10, 986210(2022).</li>
<li>Stefanov, B. -A., Mansouri, M., Charpin-El Hamri, G. -, Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sunlight-Controllable+Biopharmaceutical+Production+for+Remote+Emergency+Supply+of+Directly+Injectable+Therapeutic+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Sunlight-Controllable Biopharmaceutical Production for Remote Emergency Supply of Directly Injectable Therapeutic Proteins.</a> Small. 18 (41), e2202566(2022).</li>
<li>Rzeszutek, I., Maurer-Alcalá, X. X., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+genome+rearrangements+in+ciliates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Programmed genome rearrangements in ciliates.</a> Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4615-4629 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Mikroskop Axiovert 40 CFL (10x, 40x lensler)</td><td>Zeiss</td><td>Na</td><td></td></tr><tr><td>B-sitosterol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>567152</td><td></td></tr><tr><td>sığır serum albümini (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>CellTram Yağı</td><td>Ependorf Hakkında</td><td>Na</td><td></td></tr><tr><td>kodon optimize edilmiş 3xHA-turboID DNA dizisi</td><td>Büküm biyobilimi</td><td>Na</td><td>GCTAGCTATCCATAcGAaGTTC CTGATTATGCTTATCCTTACGAT GTTCCTGATTATGCTTATCCTTAT GATGTACCTGATTACGCTGGATC AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA ATTAATCGCTTTATTAGCTAATGG TGAATTTCATTCTGGTGAACAAC TTGGTGAAACTTTAGGTATGTCA AGAGCTGCTATTAATAAACACATT CAAACTTTAAGAGATTGGGGTGT TGATGTTTTTACTGTCCCTGGTAA AGGATATTCACTTCCTGAACCCAT TCCTTTATTAAATGCTAAACAAAT TTTAGGTCAATTAGATGGAGGTT CTGTTGCTGTTTTACCTGTTGTT GACTCAACTAATCAATATTTATTAG ATAGAATTGGTGAATTAAAGTCAG GTGATGCTTGTATTGCTGAATACC AACAAGCTGGTAGAGGTTCAAGA GGTAGAAAATGGTTTTCTCCTTTTTT GGTGCTAATTTATACCTTTCCATGT TCTGGAGACTTAAAAGAGGTCCCG CAGCTATTGGATTAGGTCCTGT TGGTATTGTTATGGCTGAAGCTCT TAGAAAATTAGGTGCTGATAAGGT TAGAGTTAAATGGCCTAATGATTTA TATCTTCAAGATAGAAAACTTGCT GGTATACTTGTTGAATTAGCTGGT ATTACTGGTGATGCCGCTCAAATT GTTATCGGTGCTGGTATTAATGTTG CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG TTGTTAATCAAGGTTGGATTACTCT 2 TCAAGAAGCTGGTATAAATCTTGAT AGAAACACTTTAGCTGCTACTCTCA TTAGAGAACTTAGAGCTGCTTTAGA ATTATTTGAACAAGAAGGTTTGGCT CCTTATCTTCCTAGATGGGAAAAAT TAGATAATTTCATTAATAGACCTGTTA AATTAATTATTGGTGATAAAGAAATTT TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAAC AAGGAGCTCTTTTATTAGAACAAGATG GTGTTATCAAACCATGGATGGGTGGT GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAA GAAATGA</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fischer Bilimsel</td><td>AAA151610B</td><td></td></tr><tr><td>epT.I.P.S. mikro yükleyici uçları</td><td>Ependorf Hakkında</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Grogg Kimyası</td><td>1009832500</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Ependorf Hakkında</td><td>Na</td><td></td></tr><tr><td>Femtotip II</td><td>Kalibre Bilimsel</td><td>5242957000</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Uygulama Kimyası</td><td>10021259</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG antikoru, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fischer Bilimsel</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>HA-tag (C29F4) tavşan mAB</td><td>Hücre Sistemleri</td><td>3724</td><td></td></tr><tr><td>InjectMan NI 2</td><td>Ependorf Hakkında</td><td>Na</td><td></td></tr><tr><td>hafif orta</td><td>Na</td><td>Na</td><td>2,5 mM Na2HPO4 içinde 0,2x buğday çimi tozu çözeltisi</td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8691 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Fenol-Kloroform-İzoamilalkohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77617</td><td></td></tr><tr><td>fosfor tamponlu salin&nbsp;</td><td>Fischer Bilimsel</td><td>10722497</td><td></td></tr><tr><td>Plazmit artı midiprep kiti</td><td>Qiagene</td><td>12945</td><td></td></tr><tr><td>zengin ortam</td><td>Na</td><td>Na</td><td>2,5 mM Na2HPO4 içinde 1x buğday çimi tozu çözeltisi</td></tr><tr><td>Streptavidin-FITC</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>11-4317-87</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC GV santrifüj filtre&nbsp;</td><td>EMD Milipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>Yıkama solüsyonu</td><td>Na</td><td>Na</td><td>Volvic suyunda %0.1 BSA&nbsp;</td></tr><tr><td>buğday çimi tozu çözeltisi</td><td>Pines uluslararası</td><td>Na</td><td>Daha önce açıklandığı gibi tozdan 20x stok olarak hazırlayın (0,5 g/10 mL)</td></tr><tr><td>Streptavidin-HRP</td><td>ABCAM</td><td>AB7403</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin kaplı manyetik boncuklar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>LSKMAGT02</td><td></td></tr><tr><td>Aşağı çekme için lizis tamponu</td><td>Na</td><td>Na</td><td>50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; %0,5 Sodyum deoksikolat; %1 Triton X-100; 5 mM MgCl2; 2x cOmplete proteaz inhibitörü (Roche); &nbsp;</td></tr><tr><td>Aşağı çekme için yıkama tamponu 1</td><td>Na</td><td>Na</td><td>50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; %0,5 Sodyum deoksikolat; %1 Triton X-100; 5 mM MgCl2;</td></tr><tr><td>Aşağı çekme için yıkama tamponu 2</td><td>Na</td><td>Na</td><td>10 mM Tris pH 7.4; 150 mM NaCl; %0,01 NP40; 1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Aşağı çekme için yıkama tamponu 3</td><td>Na</td><td>Na</td><td>10 mM Tris pH 7.4; 150 mM NaCl;</td></tr></tbody></table>

İn vivo paramecium tetraurelia'da protein etkileşim Çalışmaları için yakınlık biyotinilasyonu

In Vivo Proximity Biotinylation for Protein Interaction Studies in Paramecium tetraurelia

Protokolümüz, bir hedef proteinin yakınındaki proteinlere kovalent bir biyotin modifikasyonunun eklenmesi için basitleştirilmiş bir yöntemi açıklamaktadır. Paramecium (Şekil 1A). Bu biyotinlenmiş proteinler daha sonra bir streptavidin pulldown kullanılarak daha da zenginleştirilebilir ve kütle spektrometrisi kullanılarak tanımlanabilir20. Yöntemin pratik bir kullanım durumunu göstermek için protokolü Nowa1 proteinine uyguladık. Bu protein, genomik yeniden düzenleme süreci için gereklidir ve lokalizasyonunda dinamik değişikliklere sahiptir12. Erken evrelerde eski somatik çekirdek ve fragmanlarda kalır, ancak daha sonra yeni gelişen çekirdekte bulunur. Özellikle, Nowa1 etkileşimli proteinlerinin etiket aracılı zenginleştirilmesi için önceki girişimlerimiz başarısız oldu (yayınlanmamış sonuçlar). Bunun nedeni muhtemelen, aşağı çekme prosedürü sırasında optimal olmayan koşullar altında kendi kendine agregasyona neden olabilecek prion proteini PrP27'ye benzerlik taşıyan karmaşık tekrarlardı21. PCR, Nowa1 kodlama bölgesini, promotörü içeren yukarı akış kodlamayan bölgesi ile birlikte amplifiye ettik. Ürün daha sonra kodon için optimize edilmiş bir turboID kodlama dizisi (Şekil 1B). Dairesel DNA enjeksiyonunun neden olduğu transgen kaynaklı susturmayı önlemek için Paramecium, vektör enjeksiyondan önce doğrusallaştırıldı. Doğrusallaştırılmış ve saflaştırılmış DNA daha sonra bu protokolde tarif edildiği gibi somatik çekirdeğe (MAC) mikroenjekte edildi. Somatik çekirdeğin daha karanlık bölgesi içinde hapsedilmiş dağınık bir damlacık, bazı başarılı enjeksiyonlarda görünür hale geldi (Şekil 1C). Başarılı enjeksiyon ve hücre bölünmesi sırasında DNA'nın hücreler tarafından amplifikasyonu daha sonra PCR ile doğrulandı. Beklendiği gibi, hücrelerin @-50'si Nowa1 yapısının enjekte edilen DNA'sı için pozitifti (beklenen ürün boyutu 685 bp) (Şekil 2). Bir sonraki adım, enjekte edilen DNA tarafından kodlanan proteinin varlığını doğrulamaktı. Alıcı vektör, üçlü bir HA etiketi ile çevrili turboID dizisini içerdiğinden, etiketi saptamak için immünofloresan boyama kullandık. Bu, enjekte edilen hücrelerin füzyon proteinini eksprese edip etmediğini ve uygun şekilde lokalize olup olmadığını doğrulamamıza izin verdi. Daha önce vahşi tip Nowa1 proteini için gözlemlendiği gibi, iki yeni gelişen çekirdekte füzyon proteininin lokalizasyonunu gösteren geç evre hücreler kullandık12. Enjekte edilen bireysel hücre hatları, füzyon proteininin farklı seviyelerini gösterdi (Şekil 3). Daha düşük bir ifade seviyesi, azaltılmış arka planın istendiği uygulamalar için faydalı olabilir, ancak bu durumda maksimum sinyali seçtik ve en yüksek ifadeyi gösteren klon 2 ile devam ettik. Daha sonra füzyon proteininin lokalizasyonunu izlemek için farklı gelişim aşamalarında örnekler topladık. Protein başlangıçta eski somatik çekirdekten oluşan çilelerde ve otogaminin erken aşamalarında ayrılmış nükleer parçalarda lokalize oldu. Nükleer anlajenin ortaya çıkması üzerine, füzyon proteini bu yeni gelişen çekirdeklere doğru geçiş yaptı (Şekil 4). Proksimal proteomun farklı aşamalarda biyotinilasyonunu teşvik etmek için, IF için hücreleri toplamadan önce kültürü 2 saat boyunca 500 μM biyotin ile destekledik. Biyotin etiketli proteinleri, floresan etiketli bir streptavidin kullanarak bir IF boyaması yoluyla görselleştirdik. Gözlenen sinyal, HA etiketli füzyon proteininin lokalizasyonuna karşılık geldi. Daha da önemlisi, biyotin ile kısa bir inkübasyon bile önemli biyotinilasyon elde etmek için yeterli olduğundan, farklı nükleer gelişim aşamalarına özgü biyotinilasyon lokalizasyonu elde etmek mümkündü (Şekil 4). Ek olarak, ek biyotin eklenmeden, enjekte edilen hücrelerde yalnızca ihmal edilebilir biyotinilasyon tespit edilebildi. Vahşi tip hücrelerde, ek biyotin ilavesi, saptanabilir bir biyotinilasyona neden olmadı (Şekil 5A). Özellikle, biyotin sadece gelişmekte olan çekirdekte birikmekle kalmadı, denatüre edici koşullarda bile proteinlere bağlı kaldı. (Şekil 5B). Streptavidin kaplı manyetik boncuklar kullanılarak, biyotinlenmiş proteinleri seçici olarak zenginleştirmek mümkün olmuştur (Şekil 6). Zenginleştirilmiş proteinler, kütle spektrometrisi kullanılarak tanımlanabilir. Bu müteakip protein tanımlama deneylerinde, takviye edilmemiş kültür ve ayrıca kaynaşmamış bir turboID proteini eksprese eden hücreler, arka plan kontrol grupları olarak kullanılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig1.jpg"> 
Şekil 1: P. tetraurelia'da yakınlık biyotinilasyonu prosedürüne genel bakış. (A) Protokolün genelleştirilmiş taslağı. (B) Tak ve çalıştır turboID alıcı vektörü için klonlama ilkesi ve Nowa1 füzyon proteini için ortaya çıkan yapı. Bu plazmitte kullanılan 3'UTR bölgesi CenH3a'dan türetilir. (C) Başarılı bir DNA enjeksiyonu üzerine somatik çekirdeğe (MAC) karşılık gelen daha koyu alan içinde bulunan görünür dağınık damlacık. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig2.jpg"> 
Şekil 2: Başarılı enjeksiyon için PCR testi. Ampisilin direncini kodlayan yukarı akış bölgesine özgü bir ileri primer (amp başlangıcı) ve Nowa1'i tamamlayıcı bir ters primer içeren bir ürün için PCR reaksiyonunun agaroz jel analizi. Ok ucu, beklenen ürün boyutunu gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig3.jpg"> 
Şekil 3: TurboID füzyon proteininin doğru lokalizasyonunu doğrulamak için immünofloresan boyama. Tavşan-anti-HA birincil antikoru (1:100) ve keçi-anti-tavşan Alexa Fluor 568 kullanılarak immünofloresan boyama, bir Nowa1-HA-turboID füzyon proteinini kodlayan DNA için pozitif bir PCR sinyali ile monoklonal Paramecium hatlarının konjuge ikincil antikoru (1:1000). Ölçek 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig4.jpg"> 
Şekil 4: Farklı gelişim aşamalarında Nowa1'e özgü biyotinilasyon. Yeni somatik çekirdeğin oluşumu sırasında ilerleyen aşamalarda monoklonal hat 2'nin immünofloresan boyaması. Kültür ortamı, optimal turboID aktivitesi için 500 μM biyotin ile desteklendi. Şekil 3'teki gibi HA-etiketi, Streptavidin-FITC (1:200) kullanılarak biotin tespit edildi. Ölçek 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig5.jpg"> 
Şekil 5: TurboID ile verimli yakınlık etiketlemesi, kültürde ek biyotin gerektirir. (A) Nowa1-HA-turboID ekspresyonunu ve 500 μM ek biyotin ile gözlenen biyotinilasyonu gösteren geç gelişim aşamasında wt ve enjekte edilen hücrelerin immünofloresan boyaması. HA-tag ve biotin Şekil 4'teki gibi tespit edildi. Ölçek 20 μm. (B) 500 μM biyotin ile kültürlenmiş ağırlık hücrelerinin HRP-streptavidin kullanılarak biyotin için Western blot analizi ve biyotinli ve biyotinsiz turboID enjekte edilmiş hücreler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig6.jpg"> 
Şekil 6: Biyotinlenmiş proteinlerin streptavidin manyetik boncuklarla zenginleştirilmesi. Streptavidin kaplı manyetik boncuklar kullanılarak yapılan bir aşağı çekme deneyinden elde edilen numunelerin biyotini için Western blot analizi. Numuneler şunlardır: Nowa1-HA-turboID hücre lizatı (giriş), bağlanmamış fraksiyon (akış), yıkama adımları (yıkama 1-6) ve boncuklara bağlı proteinler (çıkış). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

İn vivo Paramecium tetraurelia'da Protein Etkileşim Çalışmaları için Yakınlık Biyotinilasyonu

Paramecium is a major model organism for the study of molecular mechanisms involved in programmed genomic rearrangements and transposon elimination during ...

in-vivo-proximity-biotinylation-for-protein-interaction-studies

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video kullanımı ile mikro-desenli yüzeyler, protein-protein etkileşimleri sonraki analizi ile deneyler gösterir. Bu yaklaşım, canlı hücreler protein etkileşimleri tespit etmek imkanı sunar ve kantitatif bilgileri ayıklamak imkanı ile yüksek verimlilik özellikleri bir araya getiriyor.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Bu protokol bir FRET tabanlı yakınlık tahlil kullanarak nasıl görüntü protein-protein etkileşimleri açıklar.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Bu video, nematod hücrelerinde in situ protein-protein etkileşimlerini incelemek için yakınlık ligasyon testini açıklar. İlgilenilen proteinlerin yakınlığı, ikincil bir antikora bağlı bir PLA probu yardımıyla dairesel DNA şablonunu oluşturur. Prob, hücrelerde protein-protein etkileşimlerinin lokalizasyonunu sağlayan uzun tek sarmallı bir DNA ve ardından dedektör probunun hibridizasyonunu üreten amplifikasyon çözeltisi kullanılarak daha da büyütülür.

Yerinde Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Yakınlık Ligasyon Testi

Burada, sabit hücrelerde endoplazmik retikulum ve mitokondri arasındaki endojen etkileşimleri görselleştirmek ve yüksek hassasiyet ile ölçmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Protokol, bir mitokondri ilişkili zar arayüzünde inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü / glukoz-regüle proteini 75 / voltaj bağımlı anyon kanalı / siklofilin D kompleksi hedefleyen in situ yakınlık ligasyonu deneyinde optimize özellikleri.

Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi Sabit Hücrelerde

Bu el yazması Bimolecular uluslara benzeşme arıtma (BiCAP) protokolünü açıklar. BM complexed bireysel proteinler hem de konut projeleri hariç rakip bağlama ortaklarıyla oluşan iken bu roman yöntemi belirli yalıtım ve aşağı akım proteomik karakterizasyonu herhangi bir iki etkileşen proteinlerin kolaylaştırır.

Bimolecular tamamlayıcı benzeşme arıtma (BiCAP) tarafından parçalanmış çok protein sinyal kompleksleri

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Burada sunulan, protein-nüklik asit etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak uygulanabilir olan biotin etiketlerini kullanarak in vitro biyokimyasal kurallara yönelik protokollerdir.

Protein-Nüklik asit etkileşimlerini Incelemek için biotin etiketlerini kullanarak In vitro biyokimyasal asder

Bu protokol, C. elegans germline yerinde protein-protein etkileşimleri için prob yakınlık ligasyon test kullanımını göstermektedir.

Yakınlık Ligasyon Tayini kullanılarak C. elegans Germline Ribonükleoprotein Kompleksi Montaj Yerinde Algılama

Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Floresan rezonans enerji transferi (FRET), canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. Burada, histon modifiye edici enzimlerin, bitki dokularındaki gen ekspresyonunun epigenetik düzenlenmesi için hedef promotörlere onları işe alan transkripsiyon faktörleri ile ilişkisini incelemek için bir FRET protokolü sunulmaktadır.

Histon Modifiye Edici Enzimler ve Transkripsiyon Faktörleri Arasındaki Etkileşimlerin in vivo Floresan Rezonans Enerji Transferi ile İncelenmesi

Bu çalışmada, D. melanogaster yumurtalıkta TurboID tabanlı yakınlık etiketlemesi (PL) için, biyotin takviyesi ve yumurtalık diseksiyonundan transgen ekspresyonunun doğrulanmasına ve kütle spektrometresi için biyotinile peptitlerin zenginleştirilmesine kadar olan adımları kapsayan ayrıntılı bir protokol oluşturuyoruz.

In vivo (İn canlı) Drosophila melanogaster'de TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketleme Uygulaması

Öğrenin Paramecium tetraurelia'da protein etkileşimlerini in vivo yakınlık biyotinilasyonu ile nasıl çalışılır. Bu yöntem turboID ligaz kullanarak hızlı adaptasyon ve evre-spesifik biyotin etiketleme sağlar.

İn vivo Paramecium tetraurelia'da Protein Etkileşim Çalışmaları için Yakınlık Biyotinilasyonu

Daha fazla video keşfet