Name: Hedef Zenginleştirme İş Akışı Kullanarak Klinik Örneklerden Tüm Bakteri Genomları Oluşturma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Öğrenin, hedef zenginleştirme ile klinik örneklerden bakteri genomlarını nasıl dizileyebilirsiniz. Bu yöntem, Chlamydia trachomatis ve Neisseria gonorrhoeae gibi patojenler için epidemiyolojik gözetimi güçlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Lefterova, M. I., Suarez, C. J., Banaei, N., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+for+infectious+disease+diagnosis+and+management%3A+a+report+of+the+Association+for+Molecular+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing for infectious disease diagnosis and management: a report of the Association for Molecular Pathology.</a> J Mol Diagn. 17 (6), 623-634 (2015).</li>
<li>Gwinn, M., Maccannell, D., Armstrong, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+of+infectious+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing of infectious pathogens.</a> JAMA. 321 (9), 893-894 (2019).</li>
<li>Hasman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+whole-genome+sequencing+for+detection+and+characterization+of+microorganisms+directly+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid whole-genome sequencing for detection and characterization of microorganisms directly from clinical samples.</a> J Clin Microbiol. 52 (1), 139-146 (2014).</li>
<li>Gautam, S., KC, R., Leong, K. W. C., Mac Aogáin, M., O'Toole, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+step-by-step+beginner%27s+protocol+for+whole+genome+sequencing+of+human+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Methods%22%5BJournal%5D)">A step-by-step beginner's protocol for whole genome sequencing of human bacterial pathogens.</a> J Biol Methods. 6 (1), e110(2019).</li>
<li>Baert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+document+on+the+use+of+whole+genome+sequencing+%28WGS%29+for+source+tracking+from+a+food+industry+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Guidance document on the use of whole genome sequencing (WGS) for source tracking from a food industry perspective.</a> Food Control. 130, 108148(2021).</li>
<li>Didelot, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+clinical+microbiology+with+bacterial+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing.</a> Nat Rev Genet. 13 (9), 601-612 (2012).</li>
<li>Scidmore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+laboratory+maintenance+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cultivation and laboratory maintenance of Chlamydia trachomatis.</a> Curr Protoc Microbiol. 11, (2006).</li>
<li>Edmondson, D. G., Norris, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultivation+of+the+syphilis+spirochete+Treponema+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro cultivation of the syphilis spirochete Treponema pallidum.</a> Curr Protoc. 1 (2), e44(2021).</li>
<li>Pitt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+in+vitro+propagation+and+antimicrobial+susceptibility+testing+of+Mycoplasma+genitalium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Challenges of in vitro propagation and antimicrobial susceptibility testing of Mycoplasma genitalium.</a> J Antimicrob Chemother. 77 (11), 2901-2907 (2022).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+methods+for+genome+sequencing+of+Chlamydia+trachomatis+and+other+sexually+transmitted+bacteria+directly+from+clinical+swabs%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Evaluating methods for genome sequencing of Chlamydia trachomatis and other sexually transmitted bacteria directly from clinical swabs.</a> Microb Genom. 11 (2), 001353(2025).</li>
<li>Seth-Smith, H. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequences+of+Chlamydia+trachomatis+directly+from+clinical+samples+without+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture.</a> Genome Res. 23 (5), 855-866 (2013).</li>
<li>SureSelect XT HS2 DNA kits: library preparation (+/-MBC) / fast-Hyb target enrichment / post-capture pooling workflow for Illumina platform NGS. , Agilent Technologies. 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf</a> (2023).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+genomes+from+rectal+samples%3A+description+of+a+new+clade+comprising+ompA-genotype+L4+from+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis genomes from rectal samples: description of a new clade comprising ompA-genotype L4 from Argentina.</a> Microb Genom. 11 (2), 001350(2025).</li>
<li>Brown, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+whole-genome+sequencing+by+SureSelect+target+enrichment%3A+a+robust+and+sensitive+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Norovirus whole-genome sequencing by SureSelect target enrichment: a robust and sensitive method.</a> J Clin Microbiol. 54 (10), 2530-2537 (2016).</li>
<li>Dao, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+SureSelect+target+enrichment+system+for+next-generation+sequencing+to+obtain+the+complete+genome+sequence+of+bovine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Application of the SureSelect target enrichment system for next-generation sequencing to obtain the complete genome sequence of bovine leukemia virus.</a> Arch Virol. 163 (11), 3155-3159 (2018).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SureSelect+targeted+enrichment%2C+a+new+cost+effective+method+for+the+whole+genome+sequencing+of+Candidatus+Liberibacterasiaticus%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">SureSelect targeted enrichment, a new cost effective method for the whole genome sequencing of Candidatus Liberibacterasiaticus.</a> Sci Rep. 9 (1), 1-8 (2019).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ompA+sequencing+and+multilocus+sequence+typing+of+lymphogranuloma+venereum+cases+in+Buenos+Aires+reveal+new+Chlamydia+trachomatis+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">ompA sequencing and multilocus sequence typing of lymphogranuloma venereum cases in Buenos Aires reveal new Chlamydia trachomatis genotypes.</a> Microorganisms. 12 (3), 587(2024).</li>
<li>La Rosa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+anorectal+infections+by+LGV+%28L1%2C+L2+and+L2b%29+and+non-LGV+serotypes+in+symptomatic+patients+in+Buenos+Aires+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+STD+AIDS%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis anorectal infections by LGV (L1, L2 and L2b) and non-LGV serotypes in symptomatic patients in Buenos Aires Argentina.</a> Int J STD AIDS. 32 (14), 1270-1278 (2021).</li>
<li>Rodríguez Fermepin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+L2b+in+rectal+lymphogranuloma+venereum%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Microbe%22%5BJournal%5D)">More than L2b in rectal lymphogranuloma venereum.</a> Lancet Microbe. 2 (2), e55(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>8-kanallı pipet 0.5-10 &micro; L</td><td>Eppendorf Belediyesi</td><td>3125000010</td><td>Eppendorf Research&nbsp; artı, 8-kanal, 0.5-10 &mikro; L, orta gri, değişken hacimli.</td></tr><tr><td>8-kanallı pipet 10-100 &mikro; L</td><td>Eppendorf Belediyesi</td><td>3125000036</td><td>Eppendorf Research&nbsp; artı, 8-kanal, 10-100 &mikro; L, sarı, değişken hacim.</td></tr><tr><td>MBC etiketli kitaplıklar için Oligo Mix adaptörü</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5500-0147</td><td>ILM (Pre PCR) için SureSelect XT HS2 Kitaplık Hazırlama Kitinin bir parçası.</td></tr><tr><td>Viral/patojen DNA ekstraksiyon kiti kullanan otomatik nükleik asit ekstraksiyon sistemi</td><td>Qiagen</td><td>937036 (Kit) / 9001297 (Enstrüman)</td><td>Otomatik DNA ekstraksiyonu için QIAamp DSP Virüs/Patojen Kiti ile birlikte kullanılan QIAsymphony SP/AS cihazı.</td></tr><tr><td>Bağlama Arabelleği</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5190-9687</td><td>SureSelect Hedef Zenginleştirme Kiti ILM Hyb Modülü Kutu 1'in (PCR Sonrası) bir parçası.</td></tr><tr><td>DNA ekstraksiyon kiti ve otomatik cihaz</td><td>Zymo Araştırma Şirketi</td><td>D3024/D3025</td><td>Klinik örneklerden toplam DNA ekstraksiyonu için kullanılan Quick-DNA Miniprep Kiti. Manuel veya otomatik iş akışı uyumlu.</td></tr><tr><td>Son Onarım - Bir Kuyruk Enzim Karışımı</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5500-0147</td><td>ILM (Pre PCR) için SureSelect XT HS2 Kitaplık Hazırlama Kitinin bir parçası.</td></tr><tr><td>Son Onarım Kuyruk Tamponu</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5500-0147</td><td>ILM (Pre PCR) için SureSelect XT HS2 Kitaplık Hazırlama Kitinin bir parçası.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR Kimyasalları BDH</td><td>20816.298</td><td>Etanol mutlak &ge; %99,5 Ph. Eur., USP</td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli dsDNA Testli Florometre / DNA'yı ölçmek için floresan tabanlı yöntem</td><td>Thermo Fisher Bilimsel (Invitrogen)</td><td>Q33238, Q33231</td><td>1X dsDNA Yüksek Hassasiyetli (HS) Test Kitine sahip Qubit 4 Florometre.</td></tr><tr><td>Parçalanma Arabelleği</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5191-4080</td><td>SureSelect Enzim Fragmantasyon Kitinin ''5X Fragmantasyon Tamponu'' adlı parçası.</td></tr><tr><td>Parçalanma Enzimi</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5191-4080</td><td>SureSelect Enzim Parçalanma Kitinin bir parçası.</td></tr><tr><td>Yüksek kaliteli DNA polimeraz tamponu</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5500-0147</td><td>ILM (Pre PCR) için SureSelect XT HS2 Kütüphane Hazırlama Kitinin ''Herculase II Buffer'' adlı parçası.</td></tr><tr><td>dNTP'li yüksek kaliteli DNA polimeraz tamponu (5X)</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5190-9687</td><td>SureSelect Hedef Zenginleştirme Kiti ILM Hyb Modül Kutusu 1'in (Post PCR) ''Herculase II Buffer'' adlı parçası.</td></tr><tr><td>PCR amplifikasyonu için yüksek kaliteli füzyon enzimi</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5191-5688</td><td>SureSelect Hedef Zenginleştirme Kiti ILM Hyb Modül Kutusu 1'in (Post PCR) ''Herculase II'' adlı parçası.</td></tr><tr><td>Yüksek Sıcaklıkta Yıkama Tamponu</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5190-9687</td><td>SureSelect Hedef Zenginleştirme Kiti ILM Hyb Modül Kutusu 1'in (Post PCR) ''Yıkama tamponu 2'' adlı parçası.</td></tr><tr><td>Hibridizasyon Tamponu&nbsp;</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5500-0147</td><td>ILM (Pre PCR) için SureSelect XT HS2 Kitaplık Hazırlama Kitinin bir parçası.</td></tr><tr><td>İndekslenmiş dizileme primerleri</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5500-0147</td><td>ILM (Pre PCR için) için SureSelect XT HS2 İndeks Primer Çiftleri 1-96'nın bir parçası.</td></tr><tr><td>Şirket içi multipleks gerçek zamanlı PCR testi</td><td>Tib Molbiol</td><td>YOK</td><td>CYBE tespiti için Lightmix Kitlerine dayalı şirket içi geliştirilmiş ve akredite edilmiş test</td></tr><tr><td>Ligasyon Tamponu</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5500-0147</td><td>ILM (Pre PCR) için SureSelect XT HS2 Kitaplık Hazırlama Kitinin bir parçası.</td></tr><tr><td>Temizlik için manyetik boncuklar</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5191-5740</td><td>SureSelect DNA AMPure XP Boncukları.</td></tr><tr><td>Manyetik stand</td><td>Permagen Laboratuvar Gereçleri</td><td>MSRLV08</td><td>0.2mL PCR 8 Şerit Manyetik Ayırıcı 5 &micro; L ~0.2mL Hacim.</td></tr><tr><td>Sonraki nesil dizileme (NGS): Yüksek verimli kısa okuma dizileme sistemi&nbsp;</td><td>Illumina, Inc.</td><td>YOK</td><td>Illumina NextSeq150 ve MiSeq platformlarında gerçekleştirilen çift uçlu 150 bp dizileme (PE1000).</td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Biyolojik Konsept</td><td>3-07F04-H</td><td>Moleküler Biyoloji için Su, DNA/DNAse/RNaz içermez, steril, PCR İnhibitörü içermez.</td></tr><tr><td>Oligonükleotid Bloker Karışımı&nbsp;</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5500-0147</td><td>ILM (Pre PCR) için SureSelect XT HS2 Kitaplık Hazırlama Kitinin bir parçası.</td></tr><tr><td>PCR tüp şeridi</td><td>avantor, VWR&nbsp tarafından teslim edildi; &nbsp;</td><td>732-3608</td><td>Ekli Düz Kapaklı PCR tüp şeritleri.</td></tr><tr><td>Yakalama Sonrası Astar Karışımı</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5190-9687</td><td>SureSelect Hedef Zenginleştirme Kiti ILM Hyb Modülü Kutu 1'in (PCR Sonrası) bir parçası.</td></tr><tr><td>RNA Probu</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5191-6916&nbsp;</td><td>SureSelect Özel Tier4 6Mb-11.9Mb Probu, örneğin Tasarım Kimliği S3465164).</td></tr><tr><td>RNase Engelleyici</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5500-0147</td><td>ILM (Pre PCR) için SureSelect XT HS2 Kitaplık Hazırlama Kitinin bir parçası.</td></tr><tr><td>Oda Sıcaklığında Yıkama Tamponu</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5190-9687</td><td>SureSelect Hedef Zenginleştirme Kiti ILM Hyb Modülü Kutu 1 (PCR Sonrası) ''Yıkama tamponu 1'' adıyla.</td></tr><tr><td>Streptavidin boncuklar</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5191-5742</td><td>SureSelect Streptavidin Boncuklar.</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>5500-0147</td><td>ILM (Pre PCR) için SureSelect XT HS2 Kütüphane Hazırlama Kitinin bir parçası.</td></tr><tr><td>Hedef zenginleştirme yöntemi / DNA yakalama yöntemi</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>G9983-90000 Serisi</td><td>Kitaplık Hazırlama, Hızlı Hyb Hedef Zenginleştirme ve Yakalama Sonrası Havuzlama İş Akışı ile SureSelect XT HS2 DNA Kiti. Protokol Sürümü F0, Mayıs 2023. Illumina Platformu NGS için</td></tr><tr><td>C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum ve M. genitalium</td><td>Agilent Technologies / Zenginleştirici Mikrobiyoloji Laboratuvarı (İBB, UZH)</td><td>Tasarım Kimliği S3465164</td><td>Dört CYBE patojeninin multipleks yakalanması için özel olarak tasarlanmış prob seti (~242.000 prob). Çoklu referans genomlara dayalı tasarım.</td></tr><tr><td>Termal döngüleyici</td><td>Termal Kompresör</td><td>4375305</td><td>Veriti 96-Kuyulu Termal Döngüleyici.</td></tr></tbody></table>

hedef zenginleştirme İş akışı kullanarak klinik Örneklerden tüm bakteri genomları oluşturma

Generating Whole Bacterial Genomes from Clinical Samples using a Target Enrichment Workflow

Arjantin, Buenos Aires'te C. trachomatis LGV salgını üzerine yapılan bir araştırma, örneklerde bazı yeni özellikler gösterdi, yani ompA-genotip L1'e kıyasla ompA geninde 10 nükleotid ikamesi ve olağandışı bir Çok Lokus Dizi Tiplemesi (MLST) dizi tipi 2 17,18,19. Bu klinik örneklerden elde edilen genomları araştırmayı ve bunları küresel veriler bağlamına yerleştirmeyi amaçladık. Bunu başarmak için, düşük bakteri yükleri ve bol miktarda insan ve mikrobiyal DNA'nın ortaya çıkardığı zorlukların üstesinden gelmek amacıyla, klinik örneklerden bakteriyel CYBE'lerin WGS'si için doğrudan metagenomik dizileme ile bir hedef zenginleştirme yaklaşımının performansını karşılaştırdık.
Kullanılan DNA, 2017 ve 2023 yılları arasında Arjantin, Buenos Aires'te toplanan rektal sürüntü örneklerinden, %2 fetal buzağı serumu (FCS) ve antibiyotiklerle (gentamisin 25 μg/mL, vankomisin 0.5 mg/mL ve amfoterisin B 2.5 μg/mL) takviye edilmiş 2-SP ortamına (sakaroz-fosfat ortamı) yerleştirildi ve -80 °C'de saklandı veya havuzlanmış üretral, anorektal, ve Zürih Üniversite Hastanesi'nde (USZ) NAAT'ler (Nükleik Asit Amplifikasyon Testleri) tamponunda toplanan faringeal sürüntüler. Buenos Aires örneklerinden alınan DNA, silika bazlı bir manuel ekstraksiyon kiti kullanılarak ekstrakte edilirken, USZ örneklerinden alınan DNA, otomatik manyetik boncuk bazlı bir sistem kullanılarak ekstrakte edildi.
Bu çalışmaya dahil edilen tüm klinik örnekler, qPCR döngü eşiği (Ct) değerleri aşağıdaki gibi değişen, kurum içi geliştirilen bir multipleks gerçek zamanlı PCR testi (Malzeme Tablosuna bakınız) ile pozitif olarak doğrulanmıştır: C. trachomatis: 17-34, N. gonorrhoeae:  24-31, T. pallidum: 27-36 ve M. genitalium:  30-37. DNA konsantrasyonu, klinik örneklerin giriş materyalini karakterize etmek için dizilemeden önce yüksek hassasiyetli bir florometrik test kullanılarak ölçüldü (bkz. Malzeme Tablosu).
Doğrudan metagenomik dizilemeyi hedef zenginleştirme ile karşılaştırmak için, 29'u C. trachomatis, dokuzu N. gonorrhoeae, beşi T. pallidum ve üçü M. genitalium için pozitif olan 32 örnek kullandık. Doğrudan metagenomik dizileme, herhangi bir tam genomla sonuçlanmadı ve gerçekten de negatif örneklerde görülen taban çizgisinin üzerinde hedef verilere zar zor ulaşıldı. 65 °C'de hibridizasyon ile hedef zenginleştirme, her patojen için çok daha iyi sonuçlarla sonuçlandı ve bu yöntemden birçok durumda başarılı genomlar elde edildi (Şekil 1). 
Hedef zenginleştirme için optimum örnek seçimini değerlendirmek için, hedef üzerindeki okumaların yüzdesi (%OTR) ile ölçülen tanısal qPCR Ct değerleri ile genom geri kazanımının etkinliği arasındaki ilişkiyi değerlendirdik. Bu ölçüm, hedef organizmanın genomuyla eşleşen dizileme okumalarının oranını yansıtır ve zenginleştirme performansını değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. C. trachomatis için patojen yükü ile dizileme başarısı arasında anlamlı bir korelasyon bulundu ve Ct30 civarında başarı için bir Ct kesintisi oldu. Diğer hedef patojenler için veriler sınırlı olmasına rağmen, genom dizileme başarısının ağırlıklı olarak patojen yükü Ct30'un altında olan örneklerde meydana geldiği benzer bir eğilim gözlenmiştir (Şekil 2).
65 °C'lik bir hibridizasyon sıcaklığına sahip bu deney, Ct değerleri 30'un altında olan örneklere dayalı olarak C. trachomatis, N. gonorrhoeae ve T. pallidum için u-80'lik hedef zenginleştirme ile genom dizileme başarı oranları verdi. Üç M. genitalium pozitif numunenin Ct değerleri 30-37 idi ve daha düşük genom kapsamı ve ortalama okuma derinliği elde etti. Bu sonuçları iyileştirmek için, M. genitalium genomundaki düşük %G+C içeriği nedeniyle hibridizasyonun iyileştirildiği hibridizasyon sıcaklığının düşürülmesini denedik. Şu anda önerilen 62.5 ° C sıcaklık gibi daha düşük hibridizasyon sıcaklıkları kullanarak, diğer genomların geri kazanımından ödün vermeden M. genitalium genomlarının geri kazanımını iyileştirebiliriz (Şekil 3). Bu sonuçlar, hedef zenginleştirmenin klinik örneklerden değerli genomik bilgiler elde etmek için etkili bir yaklaşım olduğunu ve panel tabanlı bir tasarımda da çok çeşitli genomlara uyarlanabileceğini göstermektedir.
Başarılı bir şekilde zenginleştirilmiş C. trachomatis genomlarının filogenetik analizi, Buenos Aires'ten alınan örneklerin çoğunun ompA-genotip L2b sınıfı içinde kümelendiğini gösterdi ve bu da küresel dolaşım ile başarılı bir soy olduğunu düşündürdü. Analiz ayrıca Arjantin'de LGV'ye neden olan yeni, farklı bir soyun varlığını da ortaya çıkardı. Bu daldan alınan örnekler, diğer LGV soylarından yaklaşık 600 SNP farklıdır ve bu soy, ompA-genotip L4 olarak önerilmiştir (Şekil 4). Şekil 1, Şekil 2 ve Şekil 4'te kullanılan örneklerin ayrıntılı bir açıklaması Ek Tablo 1'de verilmiştir.
Bu bulgular, patojen çeşitliliğinin incelenmesinde hedef zenginleştirmenin değerinin altını çizmekte ve klinik örneklerden yüksek derecede genom dizileme başarısı göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig1.jpg"> 
Şekil 1: Doğrudan metagenomik dizileme ile karşılaştırıldığında hedef zenginleştirme kullanılarak genomların zenginleştirilmesi.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig1large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig4.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig4large.jpg" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/Supplementary_Table_1_RE.xlsx" target="_blank"></a>

Hedef Zenginleştirme İş Akışı Kullanarak Klinik Örneklerden Tüm Bakteri Genomları Oluşturma

Obtaining complete genomes of bacterial sexually transmitted infections (STIs) directly from clinical samples is challenging due to the presence of human ...

generating-whole-bacterial-genomes-from-clinical-samples-using-target

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz kimyasal mutagenez ve tüm genom dizileme dayalı Chlamydia genetik analiz gerçekleştirmek için bir metodoloji tarif. Buna ek olarak, enfekte olmuş hücrelerde DNA'nın değişimi için bir sistem genetik haritalama için kullanılabilir olduğu tarif edilmektedir. Bu yöntem dönüşüm sistemleri ve moleküler genetik araçları eksik mikrobiyal sistemlerine geniş uygulanabilir.

Ileri Genetik Yaklaşımlar<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

NGS dizilimi için gDNA zenginleştirme, yapısal mutasyonların incelenmesi için kolay ve güçlü bir araçtır. Bu makalede, DNA hasarının onarımında yer alan 11 genin tam dizisini basitçe analiz etme prosedürünü sunuyoruz.

Whole Sırasının NGS Analiz için bir transpozaz tabanlı Technology tarafından gDNA Zenginleştirme BRCA1 BRCA2 ve 9 Genler

Onkoloji örneklerinin hedeflenen yeni nesil dizilimi için entegre bir sistem tanımlanmıştır. Bu çapraz platform sistemi, düşük kaliteli ve düşük miktarlı tümör biyopsileri için optimize edilmiştir, düşük DNA girdilerini barındırır, iyi karakterize edilmiş çok varyantlı kontroller içerir ve kantitatif pre-analitik kalite kontrol önlemleriyle bilgilendirilen yeni bir varyant arayan içerir.

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

Biz 16S rRNA gen sıralama amplikon kullanarak bakteri topluluklarının karakterizasyonu için sürüntü nükleik asidin çıkarmak için etkili, sağlam ve uygun maliyetli bir yöntem açıklanmaktadır. yöntem birden fazla örnek türleri için ortak bir işleme yaklaşımı sağlar ve alt analitik süreçlerin bir dizi barındırmaktadır.

Bakteriyel Topluluk Karakterizasyonu Verimli Nükleik Asit Ekstraksiyonu ve 16S rRNA gen Sıralama

Burada bir protokol Metil-Bağlama DNA Yakalama sıralama (MBDCap seq veya MBD-seq) teknolojisi ve sonraki biyoinformatik analiz boru hattı kullanılarak büyük ölçekli klinik hasta tarama çalışmalarında genom DNA metilasyonu araştırmak için sunuyoruz.

Hasta Dokularda metil-bağlayıcı DNA yakalama Dizi

Yeniden elde etmek ve moleküler genetik karakterizasyon tek hücre düzeyinde bir karışımı nadir Hedef hücrelerden olmayan hedef arka plan hücrelerle hazırlamak protokolüdür. DNA kalitesi olmayan tedavi tek hücrelere eşittir ve (her iki tarama tabanlı ve analiz hedefli) tek hücreli uygulama için sağlar.

Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için

Bu el yazması yüksek üretilen iş 16S rRNA amplicon sıralama, detaylı bir standart protokolünü açıklar. Protokol dışkı örneği koleksiyonu veri analizleri ile başlayarak bir entegre, üniformalı, uygun ve ucuz protokol tanıttı. Bu protokol analiz örnekleri titiz standartları ile çok sayıda ve çeşitli denetimler sağlar.

16S rRNA Amplicon sıralama tarafından dışkı mikrobiyal karakterizasyonu için rehberli iletişim kuralı

Bu protokol, üriner bakterilerin kültleme, dizileme ve de novo hibrid genom montajı için kapsamlı bir yaklaşımı detaylandırmak. İdrar kolonizasyonuna, patogeneze ve antimikrobiyal direncin yayılmasına katkıda bulunan kromozomal ve ekstrakrozomal genetik elementlerin incelenmesinde yararlı olan tam, dairesel genom dizilerinin üretimi için tekrarlanabilir bir prosedür sağlar.

Kısa ve Uzun Süredir Okunan Dizileme Teknolojilerini Kullanarak İdrar Bakterilerinin Tam Genomlarının Üretilmesi için Hibrit De Novo Genom Montajı

Masaüstü cihazları kullanan tüm genom dizileme (WGS) stratejilerinin fizibilitesi, laboratuvar ortamında halk sağlığı ile ilgili her mikrobun genom sorgulamasını basitleştirmiştir. Bakteriyel WGS için iş akışının metodolojik bir uyarlaması tanımlanmıştır ve analiz için bir biyoinformatik boru hattı da sunulmuştur.

Oreochromis spp. Çiftliklerinden Türetilen Patojenik Bir Escherichia coli Suşunun Karakterizasyonu Tüm Genom Dizilimini Kullanarak

Klinik metaproteomik, insan mikrobiyomu ve hastalığa katkıları hakkında bilgi sunar. Karmaşık kütle spektrometresi tabanlı metaproteomik analizi ve hastalık çalışmalarıyla ilgili çeşitli klinik numune türlerinin karakterizasyonunu kolaylaştıran modüler bir biyoinformatik iş akışı geliştirmek için Galaxy platformunun hesaplama gücünden yararlandık.

İnsan Hastalığının Altında Yatan Konak-Mikrobiyom Etkileşimlerini Analiz Etmek için Galaxy Biyoinformatik Platformunda Uygulanan Bir Klinik Metaproteomik İş Akışı

Mevcut çalışma, kromozom dizisi zaten biliniyor veya ilgi çekici olmayan plazmidlerin nanopore dizileme iş akışını açıklıyor. Başlangıçta bir plazmid DNA zenginleştirme adımı, optimal plazmid dizisi derinliğini sağlar ve akış hücresi başına dizilenebilen örnek sayısını maksimize eder.

Nanopore dizileme tabanlı iş akışları kullanarak uzun okuma plazmid dizileme ve montajı

Öğrenin, hedef zenginleştirme ile klinik örneklerden bakteri genomlarını nasıl dizileyebilirsiniz. Bu yöntem, Chlamydia trachomatis ve Neisseria gonorrhoeae gibi patojenler için epidemiyolojik gözetimi güçlendirir.

Hedef Zenginleştirme İş Akışı Kullanarak Klinik Örneklerden Tüm Bakteri Genomları Oluşturma

Daha fazla video keşfet