Hedef Zenginleştirme İş Akışı Kullanarak Klinik Örneklerden Tüm Bakteri Genomları Oluşturma

Genomlar, bir patojenin ataları, bulaşması ve yetenekleri hakkında bilgi sağlayabilir. Kültürlenemeyen bakteriler için bu bilgi ancak hedef zenginleştirme yoluyla elde edilebilir. Bakteriyel patojenleri doğrudan klinik örneklerden sıralamak, ezici insan DNA'sı, çeşitli mikrobiyota ve son derece düşük bakteri yükleri nedeniyle zordur.

Çoğu durumda, örnekleme yöntemi ve titiz bakteriler nedeniyle kültür bir seçenek değildir. Bu teknolojiyi cinsel yolla bulaşan bakterilere uygularken, ompA-genotip L4 adı verilen yeni bir Chlamydia trachomatis LGV soyu keşfettik ve baskın LGV soyunun küresel genişlemesini doğrulayarak moleküler teşhis ve epidemiyolojik sürveyans için önemli bilgiler sağladık. Bu ilerleme zenginleştirme protokolü, pozitif teşhis edilmiş CYBE klinik örneklerinden tam genom geri kazanımını sağlar.

Bu tekniğin metagenomik derin dizileme, konakçı DNA tükenmesi ve nanopor adaptif dizilemeden daha iyi performans gösterdiğini bulduk. Bu patojenlerin Avrupa ve Arjantin'de dolaşımdaki türlerini araştırıyoruz. Bu, bulaşma ve antimikrobiyal yönetim hakkında bilgi verme potansiyeline sahiptir.

Başlamak için, hassas ve doğru floresan bazlı bir yöntem kullanarak klinik örneklerden alınan DNA ekstraktlarının DNA konsantrasyonunu ölçün. Her DNA örneğini, nükleaz içermeyen su kullanarak, her bir PCR tüp şeridinde 17 mikrolitrelik bir son hacimde 10 ila 200 nanograma seyreltin. 17 mikrolitre seyreltilmiş DNA içeren her bir oyuğa 3 mikrolitre parçalanma ana karışımı ekleyin.

İyice karıştırmak için 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, PCR tüp şeridini kapatın. Şeridi 10 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve içindekileri toplamak için kısa bir süre döndürün.

Ardından, PCR tüp şeridini termal döngüleyiciye yerleştirin ve parçalanma ve inkübasyon için önceden programlanmış protokolü başlatın. Ardından, tabloda gösterildiği gibi uç onarımı ve dA-tailing ana karışımını hazırlayın. Tüpü daha önce gösterildiği gibi vorteksleyin ve döndürün ve buz üzerinde tutun.

Daha sonra, 50 mikrolitre DNA fragmanı içeren her bir oyuğa 20 mikrolitre uç onarım ve dA-tailing ana karışımını pipetleyin. Şeridi kapatın ve sekiz saniye boyunca yüksek hızda girdap yapın. Şeridi kısa bir süre döndürdükten sonra tekrar termal döngüleyiciye yerleştirin.

Termal döngüleyici programı bittiğinde, PCR tüp şeridini buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, DNA parçalarını içeren her bir oyuğa 30 ila 45 dakika önceden hazırlanmış 25 mikrolitre oda sıcaklığında ligasyon ana karışımı ekleyin. Her kuyucuğa NBC etiketli kitaplıklar için 5 mikrolitre adaptör oligo karışımı ekleyin.

PCR tüp şeridini hemen termal döngüleyiciye geri yerleştirin ve programa devam edin. DNA saflaştırmasına başlamak için, manyetik boncukları 4 santigrat dereceden alın ve kullanmadan önce oda sıcaklığına gelmelerini bekleyin. Ardından, her numune kuyucuğuna 80 mikrolitre ekleyin.

PCR tüp şeridini manyetik standa yerleştirin ve her bir kuyucuğu 200 mikrolitre %70 etanol ile iki kez yıkayın. Her yıkamada bir dakika bekleyin ve manyetik boncukları bozmadan etanolü dikkatlice çıkarın. Boncukları 35 mikrolitre nükleaz içermeyen su ile beş dakika karıştırıp inkübe ettikten sonra, temizlenmiş süpernatanı her bir oyuktan dikkatlice aspire edin ve yeni bir PCR tüp şeridinde karşılık gelen bir kuyuya aktarın.

Yeni PCR tüp şeridini buzun üzerine yerleştirin ve manyetik boncukları atın. Hazırlanan yeniden yakalama öncesi PCR reaksiyon karışımını alın ve saflaştırılmış DNA kitaplığını içeren her numune kuyucuğuna 11 mikrolitre ekleyin. Her reaksiyona seçilen indeks ana onarımından 5 mikrolitre ekleyin ve PCR tüp şeridini kapatın.

Ön yakalama PCR'sini gerçekleştirmek için tabloda belirtildiği gibi PCR amplifikasyonu için termal döngüleyici programını başlatın. PCR tüp şeridini yalnızca termal döngüleyici 98 santigrat dereceye ulaştığında ekleyin. Ön yakalama PCR'sini tamamladıktan sonra, kitaplığı arındırmak için başka bir boncuk tabanlı temizleme gerçekleştirin.

PCR ürününü manyetik boncuklarla inkübe edin. Daha sonra PCR şerit tüpünü manyetik bir ayırma cihazına yerleştirin ve çözelti berraklaşana kadar 5 ila 10 dakika bekleyin. Şerit manyetik stand üzerinde kalırken, berrak süpernatanı her bir oyuktan dikkatlice çıkarın ve atın.

Daha sonra DNA'yı 15 mikrolitre nükleaz içermeyen suda ayrıştırın ve saflaştırılmış DNA kütüphanesinin DNA konsantrasyonunu ölçün. Numune hibridizasyonu için termal döngüleyiciyi burada belirtilen protokole göre programlayın. Programı başlatın ve çalıştırmayı hemen duraklatın.

Hazırlanan DNA kitaplıklarının 500 ila 1.000 nanogramını nükleaz içermeyen su kullanarak 12 mikrolitrelik son hacme seyreltin. Oligonükleotid bloker karışımını vorteksledikten ve döndürdükten sonra, her numune tüpüne 5 mikrolitre ekleyin. PCR tüp şeridini kapatın ve termal döngüleyiciye yerleştirin.

Protokolün üçüncü adımına ulaştığında termal döngüleyiciyi duraklatın. Şeridi termal döngüleyicinin içinde tutarken her numuneye hazırlanan oda sıcaklığında prob hibridizasyon karışımından 13 mikrolitre ekleyin. Karıştırmak için 8 ila 10 kez yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin.

Hava kabarcığı olmadığından emin olun ve şeridi tekrar termal döngüleyiciye yerleştirin. Ardından, tüm tüplerin sıkıca kapatıldığından emin olun. Hibritleştirilmiş kitaplığı yakalamak için, her bir tüpten tüm hacmi 200 mikrolitre önceden yıkanmış streptavidin boncuk içeren ilgili tüplere aktarın.

Streptavidin boncuklarını oda sıcaklığında yıkama tamponu ile yıkamadan önce toplayın. PCR tüp şeridi manyetik ayırıcıdan çıkarıldıktan sonra, önceden 70 santigrat dereceye ısıtılmış 200 mikrolitre yüksek sıcaklıkta yıkama tamponu ekleyin ve boncukları yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden askıya alın. Tüp şeridini kapatın, yüksek hızda girdap yapın ve daha önce gösterildiği gibi hızla döndürün.

Kapalı tüp şeridini 70 santigrat derecede termal döngüleyici bloğuna yerleştirin ve 5 dakika inkübe edin. PCR tüp şeridini termal döngüleyiciden oda sıcaklığında manyetik ayırıcıya geri aktarın. Çözüm netleşene kadar bir dakika bekleyin.

Ardından, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın. Ardından, boncukları içeren her tüpe 25 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Termal döngüleyiciyi burada gösterilen tabloda belirtildiği gibi programlayın.

Her numune tüpüne hazırlanan yakalama sonrası PCR reaksiyon karışımından 25 mikrolitre ekleyin. Süspansiyon homojen olana kadar reaksiyonu karıştırın ve PCR tüp şeridini aşağı döndürmeden güvenli bir şekilde kapatın. Kapalı PCR tüp şeridini termal döngüleyiciye yerleştirin.

PCR ürününü yeni bir tüpe aktardıktan sonra, her numune tüpüne 50 mikrolitre boncuk süspansiyonu ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi DNA temizliğini gerçekleştirin. Floresan bazlı bir niceleme yöntemi kullanarak nihai saflaştırılmış kütüphane DNA'sının DNA konsantrasyonunu ölçün. Hedef zenginleştirme, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum ve Mycoplasma Genitalium dahil olmak üzere test edilen tüm patojenlerde doğrudan dizilemeye kıyasla önemli ölçüde daha yüksek hedef okuma yüzdeleri ve dolayısıyla tam genomlarla sonuçlandı.

Genom dizileme başarısı, ağırlıklı olarak, dört patojenin tümü için qPCR döngüsü eşik değerleri 30'un altında olan örneklerde gözlendi. CT değerleri ile Chlamydia trachomatis için hedeflenen okuma yüzdesi arasında açık bir ters korelasyon vardır. Önceki 65 santigrat dereceye kıyasla 62,5 santigrat derecelik bir hibridizasyon sıcaklığı kullanılarak, diğer hedef patojenlerin performansını düşürmeden mycoplasma genitalium için genom kapsamı iyileştirildi.

Arjantin'den Chlamydia trachomatis genomlarının filogenetik analizi, L2b kanadı içinde kümelenen birçok örnek gösterdi ve önceki tüm LGV genomlarından yaklaşık 600 tek nükleotid polimorfizmi ile ayrılan ompA-genotip L4 olarak önerilen yeni bir soyu ortaya çıkardı.