Virolojide Taramalı Transmisyon Elektron Mikroskobu Tomografisi: Yüksek Basınçlı Dondurulmuş, Dondurularak İkame Edilmiş Örneklerin 3 Boyutlu Görüntülenmesi

Viral enfeksiyon, hücresel altyapıda önemli değişikliklere yol açabilir. Bu değişiklikleri üç boyutlu olarak görselleştirmek için, virüs enfekte hücrelerin görüntülemesi için STEM tomografisi kullanıyoruz. STEM tomografisi zaman alıcı ve emek yoğundur.

Bu, virüs enfekte setler gibi biyolojik örnekler için optimal numune hazırlamayı vazgeçilmez kılar. Geleneksel STEM tomografisi yaklaşık 200 nanometrelik örnek hastalıklarıyla sınırlıdır. Protokolümüz daha kalın bölümlerin 3D görüntülemesini mümkün kılar.

Bu, virüs enfekte hücrelerin ve ultra yapısal değişikliklerin daha kapsamlı bir görselleştirilmesini sağlar. Birçok onkolitik virüs zaten klinik denemelerdir; bu nedenle, dünya çapında araştırmacılar ve geliştiriciler birlikte çalışıyor ve bilim kanser tedavisinin sınırlarını zorluyor; elektron mikroskopisi ve STEM tomografisi gibi son teknoloji yöntemler yeni bilgiler sunuyor. STEM tomografisi kullanarak ve yeni hazırlık protokolleri ile diğer mikroskopi teknikleriyle birleştirerek virolojik soruları yanıtlamaya devam edeceğiz.

Başlangıç olarak, donmuş safir disklerin yüksek basınçlı dondurucudan veya HPF tutucudan depolama kapsüllerine aktarılması ve taşınması için LN-kutusunu sıvı azotla doldurun. Dondurma sürecinde LN-kutusunu doldurmak için sıvı azotla dolu bir dewar bulundurun. Yalıtımlı cımbızları hazır tutun.

HPF sonrası safir diskleri tutacak numune kaplarını hazırlayın. Bir kapak ve sıvı azotun dökülebileceği birkaç delik, yüzmemesi için küçük ağırlıklar olduğundan emin olun. Etiket kabını LN kutusuna koyarak önceden soğutma için kullanın.

Sonra örnekleri kuluçka makinesine yerleştirin. Yüksek basınçlı dondurmaya başlamadan önce safir diskleri ters ışık mikroskobu altında inceleyin; yeterli hücre ve iyi hücre kalitesi alın. HPF yapmak için, kültür kabından bir safir disk alın ve fazla ortamı çıkarmak için hızlıca filtre kağıdına sürtün.

Diski HPF tutucusuna karbon kaplamalı tarafı yukarıya bakacak şekilde yerleştirin, böylece iki numara okunabilir olur. Altın bir ara parçayı heksadekana batırın ve nazikçe safir diskin üzerine yerleştirin. Karbon kaplamalı tarafı aşağıya bakacak şekilde ara parçanın üstüne ikinci bir safir diski yerleştirin; böylece hücreler birbirine doğru bakacak şekilde sandviç konfigürasyonu oluşturun, böylece hava sıkışıp kalmadığından emin olun.

HPF tutucusunu dikkatlice ve hızlı kapatarak numune üzerindeki stresi azaltın. HPF tutucusunu yüksek basınçlı dondurucuya yerleştirin. Üreticinin talimatlarına göre kilitleyin ve dondurma işlemini başlatın.

Sonra, HPF tutucusunu LN-kutusuna aktarın. Sonra safir diskleri taşıyan ucu ön soğutma LN-kutusuna aktarın. Diskleri tutucudan dikkatlice çıkarın.

Serbest ikame çözeltisiyle dolu kapalı kriyo şişelerini, önceden soğutmuş serbest bir ikame cihazına (-90 derece Celsius) yerleştirin. Çözelti aynı sıcaklığa ulaşana kadar bekleyin. Safir disklerin transferi için cımbız, bir sneşar ve pense veya büyük cımbız ile sıvı azota batırarak önceden soğutma alın.

Yüksek basınçlı donmuş örnekleri serbest ikame cihazına aktarın. Safir diskleri birer teker ayırın, sıvı azotta kalsınlar. Ve her diski tek tek serbest ikame çözeltisi ile bir kriyo şişesine hızla aktararak diskin tamamen daldırıldığından emin olun.

Kriyo şişesini kapattıktan sonra, hemen serbest ikame cihazına geri koyun. Tüm örnekler yerleştirildikten sonra, ikame sürecine başlayabilirsiniz. Örnekler 20 derece Celsius ulaşır ulaşmaz

Numuneleri %100 aseton ile her biri 30 dakika boyunca üç kez yıkamaya devam edin. Örnekleri önceden gömmek için, örnekleri üçte biri epoksi reçine ve üçte iki aseton ile bir saat boyunca kuluçka yapın. Örnekleri üçte iki epoksi reçine ve üçte bir asetonla bir saat boyunca inkubasyon yaptıktan sonra, çözeltiyi %100 epoksi reçine ile değiştirin ve bir gece boyunca şişe kapağı açık şekilde inkübe yapın; böylece kalan aseton ertesi gün buharlaşmasını sağlayacak şekilde sapir diskleri yeni etiketlenmiş reaksiyon tüplerine aktarın.

Diskleri tüpün duvarına yatay şekilde yerleştirin, hücreli tarafın yukarıya baktığından emin olun. Daha sonra reaksiyon tüplerini kapakları açık şekilde 60 derece Celsius sıcaklığına ayarlanmış bir fırına yerleştirin ve reçineyin en az 48 saat polimerize olmasına izin verin. Epoksi reçine polimerize olduktan sonra, kapalı bir reaksiyon tüpünün ucunu yaklaşık 10 saniye sıvı azotla daldırın.

Reçine bloğunu serbest bırakmak için masadaki reaksiyon tüpünü vurun. Safir disk, gömülü hücrelere bağlı kalan karbon kaplamadan kolayca ayrılır. Gömülü örneklemde ilgi alanını seçin ve örneklem büyüklüğünü ilgi alanına daraltın.

Ultra mikroton ve elmas bıçak kullanarak, STEM görüntüleme ve STEM tomografisi için Poli-L-lizin işlenmiş glotus yüklü paralel bar ızgarasında yaklaşık bir mikrometre kalınlığında kesitler toplayın. Kolloidal altın içeren bölümleri fiducial marker olarak ele alın ve karbon kaplama uygulayın. Ultra ince kesitler kesilip incelendikten sonra örnekler görüntülemeye hazırdır.

Araştırma sorusuna dayanarak, ya parlak alan dedektörünü, karanlık alan dedektörünü ya da her ikisini ekleyin. Tarama modunu etkinleştirin ve numunenin test görüntüsünü alın. 800.000 katın üzerinde bir büyütme seçin, bu da nihai istenen büyütmeden daha büyüktür.

İlgi alanına yakın, kritik örnek alanlarında doğrudan ışın maruziyetinden kaçınarak odağı ayarlayın ve astigmatizmayı düzeltin. Eksantrik yüksekliği ilgi alanına ayarlayın, yoksa ROI eğim aralığı boyunca merkezde kalır. Yatırım getirmesine yakın bir özellik seçin, merkeze getirin, odaklanın, astigmatizmayı düzeltin ve sahneyi adım adım olarak eksi 72 dereceye doğru eğin.

Görüş alanını seçmek için ROI'ya geri dön, onu netleştirin ve genel bir görüntü yakalayın bir görüntü. Tilt serisi edinimi için istenen son büyütmeyi ayarlayın. Otomatik eğimli seri görüntü alımını kurun; en 72 dereceden artı 72 dereceye kadar değişir ve her 1,5 derecede bir görüntü alın.

Otomatik tilt serisi edinimini başlatın. STEM termogramından alınan temsil sanal dilimler, virion yöneliminin karakteristik mermi şeklinin iki boyutlu görünümlerde görünürlüğünü nasıl etkilediğini göstermiştir. Sadece görüş düzlemine paralel hizalanmış virionlar tam iyi tanımlanmış mermi morfolojisine sahip olurken, diğerleri eğim açısına bağlı olarak dairesel veya uzun görünüyordu.

2D görüntülemenin yönelim sınırlamalarını aşmak için, STEM tomografisi kullanılarak büyük tomurcuklu rekombinant veziküler stomatit virüsü virionu kümeleri yakalanarak virion şeklinin yön önyargısı olmadan üç boyutlu değerlendirilmesini sağladı. Termogramın yan görünümü, STEM tomografisinin tek bir 600 nanometre kalınlığında birçok tam virionu yakalamasının hacimsel avantajını doğruladı; buna karşılık, 200 nanometrelik TEM kesitiyle sınırlı bir deneme yapılabilir.