Kütle Spektrometrisi ile Epigenetik Profilleme için Klinik Örneklerden Histonların Ekstraksiyonu

Araştırmamızın kapsamı, kanser örneklerindeki epigenetik değişiklikleri analiz etmek, yeni tanısal ve prognostik biyobelirteçler keşfetmek ve tedavi için potansiyel hedefleri belirlemektir. Klinik örneklerle ilgili en büyük zorluklardan biri, sınırlı materyal ve fiksasyonla indüklenen artefaktlardır. Ancak, optimize edilmiş iş akışımız ve DI hassasiyet MS ile sadece 1000 hücreden 50 histon PTM'e kadar nicelik oluşturabiliyoruz.

Kütle spektrometrisinin klinik örnekteki histon PTM değişikliklerini niceleştirebileceğini göstererek, epigenetik mekanizmaya dair içgörü sunmayı ve hassas epigenetik tedaviler için biyobelirteç keşfi ile ilaç hedefi tanımlamasını mümkün kıldığını gösteriyoruz. Protokolümüz, çeşitli klinik örneklerde histon PTM üzerinde sağlam, nicel ve hassas profilleme ihtiyacını karşılar. Kütle spektrometrisi, histon PTM analizi için idealdir; aynı peptidde tarafsız tespit, eşzamanlı profilleme ve birlikte ortaya çıkma sunar ve böylece antikor tabanlı yöntemlerin sınırlamalarını aşır.

Başlamak için, taze donmuş dokuyu buz üzerinde eritin ve bir nestertel veya bıçak kullanarak yaklaşık 20 ila 30 miligramlık bir parça kesin, bu yaklaşık iki milimetreküp dokuya karşılık gelir. Kesilmiş doku örneğini 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Makas kullanarak dokuyu küçük parçalara doğrayın.

Belirtilen proteaz inhibitörleriyle takviye edilmiş yeni hazırlanmış çekirdek izolasyon tamponu bir mililitre ekleyin ve dokuyu tekrar doğrayın. Örneği aşağı homojenizatora aktarın. Önce gevşek havan, sonra sıkı tokmakla dokuyu homojenleştirerek çıplak göze görünen parça kalmayınca.

Homojenleştirilmiş numuneyi 100 mikrometrelik hücre süzgeciyle filtreleyerek doku kalıntılarını ortadan kaldırın. Filtrelenen örneği 200 mikrolitrelik bir pipetle plazma zarını çözerek sertleştirerek yukarı aşağı sertçe pipetleyin. Örneği yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın.

Tüpü bir tezgah üstü santrifüge yerleştirin ve 2,300 G'de 15 dakika boyunca dört derece Celsius'ta döndürerek çekirdekleri pelet edin. Süpernatant atıldıktan sonra, nükleer pelleti 50 ila 100 mikrolitre çekirdek izolasyon tamponu içinde yeniden askıya alın ve %0,1 SDS ile takviye edilip nükleer zarı çözülür. Daha sonra süzülmüş numuneye 250 birim Benzonaz nükleaz ekleyerek nükleik asitleri sindirin.

İyi karıştırın ve 37 derece Celsius'ta iki dakika kuluçka yapın. Optimal kesme sıcaklığı için donmuş örnekler için dokuları etanol suyu ve PBS ile yıkayıp doğrayıp histon çıkarımı yapın. FFPE örneğine bir mililitre parafin çözündürücü madde ekleyin; bu madde 1,5 mililitrelik bir tüpte alınır ve parafin tamamen çözülene kadar maksimum hızda 30 saniye boyunca girdabla kalın.

Numuneyi oda sıcaklığında üç dakika boyunca 16.000 G'de santrifüjle edin ve süpernatantı küçük bir ucu olan bir pipetle dikkatlice atarak pelletten kaçının. Şimdi pellete bir mililitre %95 etanol ekleyin ve maksimum hızda 30 saniye boyunca girdap yapın. Numuneyi oda sıcaklığında üç dakika boyunca 16.000 G'de santrifüjle edin ve üst yüzeyi atın.

Numune yeniden hidrelendirildikten sonra, pellete 200 mikrolitre ekstraksiyon tamponu ekleyin. Çıkarma tamponundaki dokuyu üç milimetrelik mikro uç kullanarak dijital bir işaretleyici ile dolaşarak homojenleştirin. Homojenizasyondan sonra, örneği termomikserde kuluçka yapın ve formaldehitin buharlaşması için tüp kapağını kısa bir süreliğine açın.

Numune santrifüjlendikten sonra, süpernatantı yeni etiketlenmiş bir tüpe aktarın. 10 ila 18 kilodalton arasında bulunan çekirdek histon proteinlerinin moleküler ağırlığına karşılık gelen jel bantlarını bir bistürle çıkarın. Jel bantları kesildikten sonra aynı bistürle kesilen jel parçalarını 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Jelin detenini yapmak için, çift damıtılmış suya %50 asetonitril çözeltisi ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca dakikada 1.400 devir hızında termomikserde inkübe yapın. Jel parçalarını %100 asetonitrile ekleyerek kurutun. Termomikseri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca dakikada 1.400 devir ile karıştırın.

Üst malzemeyi attıktan sonra, jel parçalarını oda sıcaklığında vakumlu santrifüjde beş dakika boyunca kurutun. Sonra, her tüpe 15 mikrolitre 7,7 moler proponikanhidrit çözeltisi ve 26 mikrolitre bir molyar amonyum bikarbonat ekleyin ve kuluçka yapın. Sonra örneği 80 mikrolitre tek molar amonyum bikarbonatla kuluçkaya geçirin.

Sonra jel parçalarını çift damıtılmış suyla üç kez yıkayın ve her kuluçkadan sonra sıvıyı atın. Sonra, jel parçalarına %50 aseton nitril ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca dakikada 1.400 devir hızla inkübe edin. Sonra jel parçalarını tamamen kurutmak için %100 asetonitril ekleyin.

Oda sıcaklığında 1.400 devir hızında termomikserde 15 dakika boyunca inkübe yapın. Sıvıyı attıktan sonra, jel parçalarını oda sıcaklığında vakumlu santrifüjde beş dakika kurutulun. Her tüpte jel parçaları içeren her tüpe dört mikrolitre tripsin çözeltisi ve 20 mikrolitre sindirim tamponu ekleyin.

Tüpleri buzda 10 dakika kuluçka yapın, böylece tripsin jele emilmesini sağlar. Tripsin tamamen emildikten sonra, jel parçalarını tamamen kapatmak için 80 mikrolitre sindirim tamponu ekleyin ve tüpleri 37 derece Celsius sıcaklığında bir termomikserde gece boyunca inkübe yapın. Sindirilmiş peptitleri çıkarmak için, her tüpe 100 mikrolitre %100 aseto nitril ekleyin ve oda sıcaklığında termomikserde 20 dakika boyunca dakikada 1.400 devir hızında inkübe yapın.

Şimdi, süpernatantı dikkatlice topla ve yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktar. Aceto nitro ekstraksiyonunu kalan jelle tekrarladıktan sonra süpernatantları bir araya getirin. Biriktirilen peptitleri hacim bir ile beş mikrolitre arasında olana kadar vakum santrifüjünde yoğunlaştırın.

Sonra iki mikrolitre bir molyar trietilamonium bikarbonat ve üç mikrolitre fenil izosiyanat çözeltisi ekleyin. Örneği 37 derece Celsius sıcaklığında 90 dakika boyunca dakikada 350 devir hızında termo mikserde inkübe edin. Derivizasyonu durdurmak için her tüpe sekiz mikrolitre %1 trikloroasetik asit ekleyin.

Son olarak, her örneği 100 mikrolitre tampon A ekleyerek seyreldin ve seyreltilmiş örnekleri C18 aşama uçlarına yüklemek için elüsyon için kullanın. Histon ekstraksiyonu, her doku tipine özgü diferansiyel işlem akışları kullanılarak taze dondurulmuş, OCT dondurulmuş ve FFPE örneklerinden başarıyla gerçekleştirilmiştir. Daha düşük zenginleşme ve arka plan protein varlığına rağmen, histon H3, H2A, H2B ve H4, FFPE örneklerinden başarıyla çıkarılmıştır; bu da FFPE1 ve FFPE2 bantlarıyla gösterilmiştir ve yaklaşık bir mikrogram H3.1 standardıyla hizalanmıştır.

FFPE kaynaklı histonların nano sıvı kromatografisi ve MS analizi, toplam iyon kromatogramında net tutma süresi zirvelerinin görüldüğü 55 dakikalık gradyan üzerinde histon peptitlerinin başarılı ayrıldığını gösterdi. Çıkarılmış iyon kromatografileri, H3 K dört'ün değiştirilmemiş ve metillenmiş formlarının tespit edilip nicelendirildiğini, her M x Z değeri için ayrı elülasyon profilleriyle doğruladı. Her modifikasyon için yüzde göreli bolluk hesaplanmasını mümkün kılar.

Normal ve tümör örnekleri arasındaki histon modifikasyonlarının karşılaştırmalı analizi, tümör dokularında bazı tiplerde anlamlı artışlar ve diğer tiplerde azalma göstermiştir.