Oral Skuamöz Hücreli Karsinomun Farenin Preklinik Modelleri İçin Translasyonel Olarak İlgili Tümör Rezeksiyon Modeli

Bu çalışma, ağız kanserlerinin incelenmesine odaklanmakta ve ortotopik tümör rezeksiyonu ve nüksü için pratik bir preklinik model oluşturmaktadır. Ameliyat, ağız kanseri hastalarının çoğunluğu için birincil tedavi yöntemidir. Bu protokol bunu araştırmamıza olanak tanıyor.

Başlamak için, %80 birleşen Mach Two ağız kanseri hücreleri içeren bir kültür şişesi alın. Kültür medyasını şişeden çıkarın. Bağlı hücreleri magnezyum ve kalsiyumsuz PBS ile yıkayarak kalan serumu çıkarın.

Hücrelerin bulunduğu kabın yüzeyini tamamen kaplayacak kadar hacim ekleyin, ardından aspirasyon yapın. Kültür termosuna %0,05 tripsin ekleyin, böylece alt yüzeyi yeterince kaplayın. Şüşəni yaklaşık 5 dakika boyunca %5 karbondioksit ile 37 derece Celsius sıcaklığında kübeleme yapın, böylece hücre ayrılmasına izin verin.

Hücre ayrılması gözlemlendiğinde, tripsin en az iki katı hacmi ekleyerek tam ortamın hacmini azaltabilir. Enzimatik aktiviteyi durdurmak için nazikçe karıştırın. Hücre süspansiyonunu santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 350G santrifüj yapın.

Santrifüjlemeden sonra süpernatantı atın. Hücre pelletini soğuk PBS'ye yeniden askıya alın. Hücre sayımı için askıya alın.

Ek PBS kullanarak, hücre süspansiyonunu aşılama için optimize edilmiş konsantrasyona ayarlayın. Hazırlanmış hücre süspansiyonunu kullanıma hazır olana kadar buzda tutun. Hücre süspansiyonunu iyice karıştırarak hücre dağılımı eşit olur.

Süspansiyonu 0,3 mililitrelik bir insülin şırıngasına toplayın. Anestezi altındaki fareyi bir elinizle arka boyundan tutun, böylece ön taraf bakıcıya bakacak ve baş yukarı doğru açılı olsun. Ağzı açık ve erişilebilir bir konumda tutun.

Şırıngayı dikkatlice açık ağıza sol alt mandibular vestibüle doğru aşağı açıyla yerleştirin. İğneyi alt bukkal mukozadan geçirin. Hücre süspansiyonundan 30 mikrolitre hedef bölgeye iletin.

Şırıngayı 5 saniye yerinde tutun, sonra hücrelerin izini önlemek için yavaşça çekin. Aşılamadan sonra farenin normal fiziksel ve davranışsal duruma döndüğünden emin olun. Tümörler geliştikçe, anestezi altındaki farenin ağırlığını denge kullanarak izleyin ve tümör büyümesini haftada iki kez dijital kaliperlerle değerlendirin.

Kapatılabilir kapısı olan ve sınırlı trafikli temiz bir prosedür odası seçin. Temiz, kuru yatak takımı ve kağıt havlu yuvası içeren yeni bir kafes, elektrikli ısıtıcının üzerine kısmen yerleştirerek önceden ısıtın. Boncuk sterilizatörü 250-265 derece Celsius çalışma sıcaklığına kadar ısıtın.

Suyla ısıtılan cerrahi pedi açın ve yaklaşık 39 derece Celsius'a ayarlayın. Anestezi edilmiş bir farede tümör rezeksiyon bölgesine pamuk ucu aplikatörü kullanarak az miktarda tüy alma kremi uygulayın. Kesi bölgesinden saçların uzak tutulması için yeterli kenar ayırın.

10 saniye sonra, kuru ve temiz gazlı bezle saçınızı silin. Kalan kremi gazlı bez veya suyla nemlendirilmiş pamuk çubuklarıyla çıkarın. Anestezi edilmiş fareyi ısıtıcı pedin üzerine sırtüstü pozisyonda ön tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.

Burnu burun konisi içine yerleştirin. Şimdi işlem sırasında kurumayı önlemek için her göze yeterli miktarda steril kayganlaştırıcı merhem uygulayın. Temiz pamuklu uçlu aplikatör kullanarak, rezeksiyon bölgesini %70 izopropil alkol ve %10 iyot ile salın, ardı üç kez tekrarlanın.

Son geçişten sonra %70 izopropil alkolle iyotu çıkarın. Steril eldivenler ve uygun kişisel koruyucu ekipmanlar takarak, en az 18 inç genişliğinde ve 26 inç uzunluğunda steril bir alan hazırlayın. Gerekli tüm steril aletleri ve malzemeleri yerleştirin.

Fareyi steril bir perdeyle örtün. Steril makas kullanarak, rezeksiyon alanının üzerinde bir erişim deliği açın. Yeni bir cerrahi skarpel ile, sol çene hattı boyunca tümörün hemen altında submandibular bir kesi oluşturun.

Hartmann hemostatları kullanarak, tümöre doğru kesi açıklığını nazikçe genişletin. Gerekirse kanı steril gazlı bezle sil. Tümörü bulun ve forseps ile yerinde tutun.

Steril PPE giyen bir asistan, bu işlem sırasında fareyi veya derisini yerinde tutabilir. Cerrahi makas kullanarak, tümörün tabanını keserek tüm görünür dokuları kesin. Deriyi rezeksiyon edilen tümör bölgesinin üzerine yeniden konumlandırın, ardından 4/0 uzun süreli Vicryl dikişlerle 4-6 kesintili dikişle kesiyi kapatın.

Kesiyi kapattıktan sonra, fareyi önceden ısıtılmış kafese nazikçe taşıyın ve tam iyileşmeye kadar bilinç ve hareketliliğin geri dönüşünü izleyin. Kafesteki erişilebilir bir kaba su sabunlu peletler koyarak hemen yumuşatılmış yiyecekler verin. Herhangi bir komplikasyon olmazsa, farenin normal katı beslenmesine bir sonraki rutin beslenmede devam edin.

Mach Two hücre hattı kullanılarak, tümörler ağız boşluğunun bukkal mukozasında kuruldu ve oradan çıkarıldı. Tümör büyüme kinetiği rezeksiyondan önce karakterize edildi. Tümör rezeksiyonundan sonra, ameliyattan hemen sonraki günlerde tümör büyümesinde gecikme gözlemlendi; bu, rezeksiyondan kısa süre sonra tümör alanının rezeksiyon yapılmamış tümörlerle karşılaştırıldığında azalmasıyla kanıtlanmıştır.

Rezeksiyon yapılan grupta, rezeksiyon yapılmamış kontrol grubuna kıyasla genel hayatta kalmada hafif bir uzantı gözlemlendi, ancak bu fark istatistiksel olarak anlamlı değildi. Rezeksiyon yapılmamış gruptaki fareler ameliyattan sonraki 12. güne kadar ötenazi kriterlerine ulaşmış, rezek edilen gruptaki fareler ise 19. güne kadar ötenazi kriterlerini karşılamamıştır. Bu protokolü kullanırken en önemli husus, tümör aşılanması ve aşılanmasında tutarlılıktır.

Bu işlemin ötesinde, rezeksiyon edilen tümörleri akış sitometrisi veya immünohistokimya ile analiz etmek üzere işleyebiliriz. Gelecekteki çalışmalar, ek tedavilerle birleştirerek bu çalışmayı geliştirebilir. Ayrıca tümör bağışıklık mikroçevresinin rezeksiyon ve yeniden oluşumla ilgili araştırmasını da inceleyebilirsiniz.