İnfluenza Virüslerinin Kriyo-elektron Tomografisinden Hemaglutinin'in Nanometre Altı Çözünürlükte Yapısal Tayini

Laboratuvarımız, virüsleri ve ilaç direncinin evrimini incelemek için yapısal biyolojiyi kullanıyor. Mevcut çalışmada, grip hemagglutinin reseptör bağlanması sırasında konformasyonu nasıl değiştirdiğini karakterize ediyoruz. Viral morfoloji, organizasyon ve yapıyı görselleştirmek için kriyo-elektron tomografisinden yararlandık.

Özellikle, bu kriyo-elektron mikroskopi modalitesini pleomorfik virüs gripini görüntülemek için kullandık. Protokolümüz, grip hemagglutinin in situ olarak sağlam virüslerde nanometre altı çözünürlükte çalışmamıza olanak tanır. Bu yüksek çözünürlük, önceden gizli olan etkileşimleri görselleştirmemizi sağlıyor.

Başlamak için, Conda ortamını etkinleştirmek için bir Linux terminali başlatın. ISO ağı yüklü Conda ortamını etkinleştirmek için terminali kullanın. Tomo klasörü adında bir alt klasör oluşturun, ardından tüm tomogram dosyalarını o klasöre taşıyın.

Sonra, bu kodu kullanarak proje klasöründe bir yıldız dosyası oluşturun. Bir metin düzenleyici kullanarak, oluşturulan yıldız dosyasını açın ve sıfır derece eğimli görüntüler için yaklaşık odaksızlık değerini dördüncü sütuna girin. Şimdi terminalde CTFD konvolüsyon komutunu çalıştırın.

Dekonvolvasyondan sonra EMAN2 GUI ortamını aktive ederek parçacık seçme için ön işlemeye başlayacak. Tomografi altında, ham verinin yanındaki oku sol tıklayın, açılır menüden tomografileri import edin ve dosyaları seçin. Sonra, segmentasyonun yanındaki oku sol tıklayın ve önceden işlenmiş tomogramları seçin.

Uygun varsayılan parametreleri kullanın. Ön işlemden sonra, süreç tomografisi dosyalarının temel isimleriyle eşleşen boş JSON dosyalarının bulunduğu bir bilgi dizini otomatik olarak oluşturulur. Devam etmeden önce dosyalara angstrom piksel bilgisi ekleyin.

HA glikoproteinini tanımak için konvolüsyon sinir ağı (CNN) eğitmek için, çalışma dizinini kullanılacak tomogramların konumuna değiştirin. Sonra terminali kullanarak CNN eğitim arayüzünü açın. Dört pencerenin açık olduğunu doğrulayın.

Biri dizindeki CNN parametreleri ve tomogram bilgilerini içerirken, diğer üç pencerede iyi, kötü referanslar ve CNN tarafından seçilmiş parçacıkların görüntüleri yer alıyordu. CNN arayüzünde, varsayılan öğrenme hızı 0.0001 ve kutu boyutu sekiz olan bir CNN'i başlatmak için yeni seçeneğe tıklayın. Dosya adı sütununda, temsil eden bir tomogramı açmak için sol tıklayın.

İmleci açık tomogramın üzerine getirin ve fare kaydırma tekerleğine tıklayarak yeni bir pencere açın. Z ekseni boyunca ilerlemek için N sayı kaydırıcısına sol tıklayın. Sonra, açık tomogramda, HA'ya karşılık gelen 10 ila 20 özelliği seçmek için iyi referanslar panelini kullanın. Pozitif görüntüler pozitif pencerede görünür.

Birini çıkarmak için shift tuşuna basılı tutup sol tıklayın. Şimdi kötü referanslar paneline geçin ve boş membran yamaları, RNP yoğunluğu, fiducial işaretçiler ve debris gibi özelliklere karşılık gelen 10 ila 20 referans seçin. Iterasyon sayısını 50'ye ayarlayın ve CNN eğitimine başlamak için tren simgesine tıklayın.

Eğitim tamamlandıktan sonra uygula basın. Seçilen parçacıklar tomografide mavi daireler halinde gösterilir veya parçacıklar penceresinde görülebilir. Ek olumlu ve olumsuz referanslar seçerek iyileştirmeye devam edin, ilerlemeyi korumak için periyodik olarak kaydet'e tıklayın.

CNN tatmin edici şekilde çalıştığında, parçacık seçme işlemi yapmak için hepsini uygula tuşuna tıklayın. Sonra birkaç tomogramda sonuçları değerlendirin ve gerektiğinde yeniden eğitim yapın. Her tomogram için koordinatları kaydetmek için, EMAN2 GUI'sini e2projectmanager.py komutuyla yeniden açın.

Subtomogram ortalaması altındaki oku tıklayıp manuel boxing'i seçin. Şimdi, tomogramın adını girin ve başlat tuşuna tıklayın. Sonra, ardışık olarak dosya, kayıt kutusu kablosu ve tomogram_ha üzerine tıklayın.

koordinatları kaydetmek için txt. Yedekleme ve net kaydetmek için sinir ağı alt klasörüne ve bilgi alt klasörlerine gidin. HDF, tren çıkıntıları.

HDF, Segouts. hdf ve boxes3Dref.hdf. İkinci bir CNN'i M1 protein tabakasını ve VRNP varlığını tespit etmesi için eğitim kutusu boyutunu sekizden 14'e değiştirerek eğitin.

Parçacıkları kürelemek için önce GitHub deposundan defterleri indirin. Sonra CNN parçacık dosyasını açıp IPYNB notebookunu temizleyin ve gerekli modülleri yükleyin. HA ve M1 koordinat metin dosyalarını not defterine yükleyin.

Açık 3D kütüphaneyi kullanarak 3D bulutlar olarak görüntüleyin. Sonra, açık 3D istatistiksel outlier kaldırma yöntemiyle HA koordinat outlier'larını filtreleyin. Sonra, M1'den 20 pikselden fazla HA noktalarını outlier olarak belirleyerek HA ve M1 nokta bulutları arasındaki mesafeleri hesaplayın ve kalan koordinatları çıktı metin dosyasına kaydedin.

Tüm parçacıkları birleştirin ve pts2 yıldız dosyası kullanarak yıldız dosyası olarak kaydedin. IPYNB. WarpTools kullanarak, bükülme faktörü dörtte olan parçacıkları çıkarır ve kod kullanarak RELION eksi dörtte başlangıç subtomogram ortalaması yapar. Warp yıldız dosyasını RELION dört formatına dönüştürün.

Sonra parçacıkların bir alt kümesi üzerinde RELION PALP MPI'yi inceleyerek ilk referans oluşturulur. RELION iyileştirme MPI ile alt tomogramlarda 3D otomatik iyileştirme gerçekleştirin. Yakınsamada, otomatik iyileştirmeyi titan çevirisi sekize kaydırarak ve step ikiye çevirerek tekrarlayın.

RELION iyileştirme kullanarak atık parçacıkları atmak için 2B sınıflandırmadan yararlanın. Kodu kullanarak iyi sınıflarla yıldız dosyaları oluşturun, ardından bireysel yıldız dosyalarını birleştirin. Temsilci tomogramlar, küresel ve uzun formlarda pleomorfik virionlar ortaya çıkardı.

Son subtomogram ortalaması, lokal çözünürlük beş ila yedi angstrom arasında değişen küresel çözünürlüğe ulaşarak 6.0 angstroma ulaştı. Alfa helisler ve beta levhalar son HA rekonstrüksiyonunda çözüldü ve bu da rafinaj haritanın yapısal kalitesini destekledi. Glikozilasyon noktaları, HA başı ve sap üzerinde dört pozisyonda tanımlanabildi ve nihai rekonstrüksiyonda glikan yoğunluğunun görünürlüğünü doğruladı.