Name: Mikroakışkan Çift Katmanlı Cihaz Kullanarak Mikrobiyal Tek Hücreli Büyüme Analizinde Hızlı Oksijen Salınımları Oluşturma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T15:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Öğrenin, çift katmanlı mikroakışkan cihaz kullanarak mikrobiyal tek hücreli büyüme analizinde hızlı oksijen salınımlarını nasıl oluşturacağınızı. Bu yöntem, oksijen değişimlerine karşı mikrobiyal tepkileri incelemek için güvenilir bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Kalıp hazırlama
<ol>
	<li>3D baskı ile üst katman için bir kalıp hazırlayın. Elde edilen PDMS üst tabakasının pürüzsüz bir yüzeyini sağlamak için üst tabaka kalıbını pürüzsüz bir yüzeyle imal edin. Stereolitografi (SLA) 3D baskı kullanmanızı öneririz.<ol>
		<li>Kalıbı 3D CAD yazılımı ile tasarlayın (Şekil 1A). Tasarımın, alttaki sıvı kanallarıyla örtüşen gaz kanalları içerdiğinden emin olun. Bu tasarım sürecini, alt katmanı tasarlamaya paralel olarak gerçekleştirin (adım 1.2.1).</li>
		<li>SLA 3D baskı kullanarak kalıbı yazdırın. Kalan reçineyi baskılı kalıptan çıkarın ve 30 dakika boyunca bir izopropil alkol (IPA) banyosunda yıkayın (Şekil 1B).</li>
		<li>Reçine tipine ve geometrisine bağlı olarak kalıbı uygun süre ve sıcaklıkta 405 nm ışığa maruz bırakarak kürleme sonrası gerçekleştirin.</li>
		<li>Kalıpta kalan kürlenmemiş reçineyi çıkarmak için kalıbın bir ultrason banyosunda 15 dakika IPA'da ıslanmasına izin verin, aksi takdirde PDMS kürlenmesini engelleyebilir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alt tabaka için bir silikon gofret kalıbı hazırlayın.<ol>
		<li>Mikroakışkan çipi CAD düzen editörü ile tasarlayın (Şekil 1C). Tasarımın girişleri, sıvı kanallarını ve çıkışları içerdiğinden emin olun.</li>
		<li>Önceki makalede açıklandığı gibi iki katmanlı fotolitografi kullanarak bir silikon gofret kalıbı oluşturun (Şekil 1D)16. NOT: Alt katmandaki kanallar μm boyutundadır ve hassas imalat gerektirirken, üst katmandaki kanallar mm boyutundadır. SLA 3D baskı, daha kısa üretim süresi ve dolayısıyla daha hızlı prototipleme sunduğundan, SLA baskı, üst katman kalıbı için oldukça büyük yapılar imal etmek için kullanıldı. Alt katman, hassas imalatı sağlamak için fotolitografi ile üretildi. Üst katmandaki kanalların da μm aralığında olması ve hassasiyet gerektirmesi durumunda, fotolitografi kullanarak da bir kalıp üretmeyi düşünün.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. PDMS çift katmanlı mikroakışkan çip imalatı
<ol>
	<li>Baz ve kürleme maddesini 10:1 oranında iyice karıştırarak PDMS ön kürleme solüsyonunu hazırlayın. Karışımı 1 saat boyunca bir desikatörde gazdan arındırın.</li>
	<li>Üst tabaka kalıbını IPA ile temizleyin ve basınçlı hava kullanarak kurulayın.</li>
	<li>PDMS'yi üst katman kalıbına dökün, ardından 80 °C'de 20 dakika süreyle termal kürleme yapın (1. kürleme adımı, Şekil 1E). 1. kürleme adımı, tam olarak kürlenmemişken PDMS'nin soyulmasına, kesilmesine ve delinmesine izin verir.</li>
	<li>20 dakikalık ısıtmadan sonra PDMS'nin yapışkanlığını elle veya cımbızla kontrol edin. PDMS hala yapışkansa, ısıtma süresini ayarlayın.</li>
	<li>PDMS'yi üst katman kalıbından soyun ve tek parçalar halinde kesin (burada 20 mm x 18 mm). Gaz girişleri için zımba delikleri (çap = 0,75 mm) (Şekil 1F). IPA ile durulayarak, basınçlı hava ile kurutarak ve yapışkan bant yapıştırarak üst tabakanın alt yüzeyini temizleyin.</li>
	<li>Alt tabaka kalıbını IPA ile temizleyin ve basınçlı hava kullanarak kurutun. Alt katman kalıbını bir spin kaplayıcı üzerine sabitleyin ve kalıbın ortasına PDMS'yi dökün. Hava kabarcıklarını azaltmak için PDMS'yi gofretin yakınına dökün. PDMS döküldükten sonra herhangi bir hava kabarcığı bulunursa, temiz cımbız veya iğneler kullanarak bunları dış tarafa doğru hareket ettirin.</li>
	<li>PDMS'yi alt katman kalıbına 1000 sn boyunca 60 rpm'de döndürün, ardından 80 °C'de 10 dakika boyunca termal kürleme yapın (1. kürleme adımı, Şekil 1G). 10 dakika sonra PDMS yapışkanlığını elle veya cımbızla kontrol edin ve gerekirse ısıtma süresini ayarlayın.</li>
	<li>Üst katman PDMS parçalarını kalıp üzerindeki alt PDMS katmanına yerleştirin ve üst ve alt katmanların yüzey tutturmasını sağlamak için üstten sıkıca bastırın (Şekil 1H).</li>
	<li>PDMS'yi en az 1 saat (2. kürleme adımı) 80 °C'de tamamen termal olarak kürleyin. 2. kürleme adımı, üst ve alt katmanların geri dönüşümsüz bir şekilde birbirine bağlandığı son PDMS kürlemesine izin verir (Şekil 1H).</li>
	<li>PDMS alt tabakasını yavaşça parçalara ayırın. Tüm PDMS çipini kalıptan dikkatlice soyun (Şekil 1H). NOT: PDMS talaşlarının kalıptan soyulması zorsa, soyma prosedürünü kolaylaştırmak için alt tabaka kalıbının silanizasyon ve kimyasal yüzey kaplaması gibi daha fazla yüzey işlemini düşünün. Soyulma sırasında üst ve alt katmanlar ayrılırsa, 1. kürleme adımı için süreyi kısaltmayı düşünün.</li>
	<li>Sıvı kanallarının her iki ucundaki sıvı girişleri ve çıkışları için delikler (çap = 0.5 mm) açın (Şekil 1H). IPA ile durulayarak, basınçlı hava ile kurutarak ve bant yapıştırarak çipin alt yüzeyini dikkatlice temizleyin.</li>
	<li>Yüzeyi plazma oksidasyonu ile aktive ettikten sonra çipi 0,175 mm kalınlığında bir kapak camı ile yapıştırın (25 s, Şekil 1H).</li>
	<li>Çipi cam alt tabakaya yerleştirdikten sonra, PDMS membran alt tabakasının cama düzgün şekilde bağlandığından emin olmak için üst tabakayı basınçlı hava ile yıkayın.</li>
	<li>Yapışma stabilitesini artırmak için yapıştırılmış çipi 80 °C'de 10 s ila 1 dakika ısıtın. NOT: Yukarıda bahsedilen PDMS kürleme adımı ve gerekli kürleme süresi, kalıp kalınlığı, ekipman ve ortam koşulları gibi çeşitli parametrelerden etkilenebilir. Bu nedenle, önerilen protokolün uygulamaya uymaması durumunda kürlenme süresini buna göre ayarlayın.</li>
</ol>
3. Deney düzeneği
NOT: Standart deney düzeneği olarak tamamlayıcı bir metal oksit yarı iletken (CMOS) kamera, bir floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM) kamerası (frekans alanı) ve bir sıcaklık inkübatörü ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılır. FLIM kameraya modüle edilmiş bir uyarma lazer kaynağı (445 nm, 100 mW) bağlanır. Gaz kontrolü için üç kütle akış kontrolörü (azot, oksijen ve karbon dioksit) kullanılır. Orta perfüzyon için şırınga pompaları kullanılır.
<ol>
	<li>Gaz (giriş) ve sıvı (giriş ve çıkış) perfüzyonu için hortumları hazırlayın. Deneyden önce istenen sıcaklığa ulaşmak için inkübatörü açın (burada 37 °C).</li>
	<li>İstediğiniz bir objektif lensi seçin (burada, oksijen algılama için 20x ve mikrobiyal gözlem için 100x) ve gerekirse daldırma yağı ekleyin. Çift katmanlı çipi yapışkanlı bir talaş tutucuya sabitleyin.</li>
</ol>
4. Çip üzerinde oksijen kontrolü ve algılama
<ol>
	<li>Uygun konsantrasyonda oksijene duyarlı bir boya çözeltisi hazırlayın (burada, 3 mM tris (2,2'-bipiridil) diklororutenyum (II) hekzahidrat, RTDP).</li>
	<li>Bilinen bir kullanım ömrüne sahip bir referans slaytı kullanarak FLIM kamerayı kalibre edin (burada 3.75 ns). FLIM kamera ile sinyal yoğunluğunu ölçün ve daha iyi kalibrasyon için 0,68 - 0,72 sinyal yoğunluğu elde etmek için pozlama süresini veya mikroskop açıklığını ayarlayın.</li>
	<li>Talaş tutucuyu mikroskop tablasına sabitleyin. Uygun hortumları sıvı girişine ve çıkışına bağlayın. Bir şırınga pompası (burada 100 nL/dak) kullanarak oksijene duyarlı boya çözeltisini sabit bir akış hızında perfüze etmeye başlayın.</li>
	<li>Gaz girişini ve kütle akış kontrol cihazlarını uygun boru ile bağlayın. Kontrollü oksijen konsantrasyonu ile gazı yıkamaya başlayın (burada %0 veya ! oksijen, toplam kütle akış hızı 600 mL/dak).</li>
	<li>Oksijen yokluğunda (τ0) ve bilinen başka bir oksijen konsantrasyonunda (burada !'de) faz ömrünü ölçün. Oksijen varlığında floresan söndürmeyi tanımlayan Stern-Volmer denklemini aşağıdaki gibi kullanarak su verme sabitini (Kq) hesaplayın. Alternatif olarak, floresan yoğunluğu (I) kullanılabilir; Bununla birlikte, yoğunluğa dayalı ölçüm, ışık kaynağı yoğunluğundaki değişikliklerden, foto ağartmadan vb. etkilenebilir. 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68697/68697eq1.jpg" style="opacity: 0.9;"> NOT: Özellikle %0 kadar düşük oksijen tükenme seviyelerini hedeflerken, doğru kalibrasyonu sağlamak için gazla yıkamaya başladıktan sonra birkaç dakika beklemeniz önerilir. Daha fazla hassasiyet için, işlemi oksijen tutucular veya ek bir sızdırmaz hazne kurulumu gibi ek oksijen tüketme yöntemleriyle desteklemeyi düşünün.</li>
	<li>Faz ömrünü ölçün ve Stern-Volmer denklemini kullanarak karşılık gelen oksijen konsantrasyonunu hesaplayın. Salınımlı oksijen koşulları oluşturmak için, nitrojen ve oksijen için hacimsel akış hızlarının ayarlanmasını otomatikleştirmek için herhangi bir cihaz kontrol sistemini kullanın.</li>
</ol>
5. Bakteri kültürü hazırlığı
<ol>
	<li>. İstenen bir organizmayı (burada, E. coli MG1655, şişe başına bir kriyo şişesinden kullanıma hazır tek boncuk) istenen bir ortamda (burada, 10 g / L pepton, 5 g / L maya özütü ve 10 g / L NaCl içeren LB ortamı) aşılayarak bir ön kültür başlatın ve gece boyunca inkübe edin (burada, 150 rpm'de 37 ° C).</li>
	<li>Elde edilen optik yoğunluğu 600 nm'de (OD600) bir fotometre kullanarak ölçün.</li>
	<li>Ön kültürü aşılayarak LB ortamında bir sonraki kültürü başlatın (burada ilk OD600 = 0.3 veya 0.0001). Kültürü üstel büyüme aşamasına ulaşana kadar kuluçkaya yatırın. NOT: Çip üzerinde yetiştirme ortamı, birinci ön kültür ortamından farklıysa, organizmaların kendilerini yeni bir ortama alıştırmalarına izin vermek için yonga üzerinde yetiştirme ortamı ile ikinci bir ön kültür yapılması arzu edilir16.</li>
	<li>Kültürü uygun bir optik yoğunluğa seyrelterek bir tohumlama çözeltisi hazırlayın. Bir sonraki adım için tohumlama çözeltisini 1 mL'lik bir şırıngaya aktarın. E. coli için, tohumlama çözeltisinin optik yoğunluğu (OD600) 0.5 civarındaydı.</li>
</ol>
6. Kontrollü oksijen koşulları altında çip üzerinde mikrobiyal yetiştirme ve hızlandırılmış görüntüleme
<ol>
	<li>Talaş tutucuyu mikroskop tablasına sabitleyin. Talaş tutucunun ve PDMS çipinin inkübatörde (burada 37 °C) birkaç saat ısınmasına izin verin, çünkü bu, sıcaklığa bağlı yer değiştirme nedeniyle zaman atlamalı görüntüleme sırasında bulanıklaşma riskini azaltacaktır.</li>
	<li>Yetiştiriciliğe başlamadan önce, toplam akış hızını ve karbondioksit akış hızını sabit tutarken oksijen ve nitrojen kütle akışının hacimsel yüzdesini ayarlayarak istenen başlangıç oksijen konsantrasyonu ile gazlamaya başlayın.</li>
	<li>Çipin gaz girişini ve kütle akış kontrolörlerini bağlayın.</li>
	<li>Şırıngayı tohumlama çözeltisi ile sıvı çıkışına bağlayarak ve şırıngayı manuel olarak iterek organizmayı çipin içine tohumlayın. Hücrelerin yetiştirme odalarında başarılı bir şekilde hapsolup olmadığını mikroskopla kontrol edin.</li>
	<li>Hücre aşılamasından sonra, şırıngayı çıkarın ve taze ortamla birlikte başka bir şırıngayı sıvı girişine bağlayın. Orta besleme kanalında kalan hücreleri temizlemek için şırıngayı manuel olarak itin.</li>
	<li>Şırınga pompası ile ortamı sabit bir akış hızında (burada 100 nL/dak) perfüze etmeye başlayın. Yeterli bir akış hızı olduğundan emin olun, çünkü yetersiz bir oran haznenin kurumasına neden olabilir. Yeterli akış hızı, akışkan kanalının geometrisi ve üst katman kanalındaki gaz akış hızı dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlı olarak değişebilir.</li>
	<li>Zaman atlamalı görüntü alımını başlatın. Salınımlı oksijen koşulları altında yetiştirme için, görüntü alımı başladığı anda kütle akış kontrolörlerinin otomatik kontrolünü başlatın. Gaz kontrolünün başlatılmasında ve görüntü alınmasında herhangi bir gecikme olması durumunda, daha sonraki görüntü veri analizi için gecikmeyi dikkate alın.</li>
</ol>
7. Görüntü veri analizi
<ol>
	<li>Zaman atlamalı görüntüyü, her konum için bir görüntü yığını olarak kaydedin.</li>
	<li>Görüntü analiz programlarını kullanarak ekili koloniyi döndürmek, hizalamak ve kırpmak için görüntüyü önceden işleyin. Önceden işlenmiş örnekler. TIF görüntüleri burada mevcuttur: https://doi.org/10.5281/zenodo.1398274715</li>
	<li>Hücreleri segmentlere ayırın ve hücre numarası, uzunluk, alan, floresan yoğunluğu vb. gibi ilgili değerleri çıkarın. Büyüme davranışlarını daha fazla analiz edin. Örnek Python betiklerini burada bulabilirsiniz: https://github.com/JuBiotech/Supplement-to-Kasahara-et-al.-202515</li>
</ol>

<ol><li>Cabiscol, E., Tamarit, J., Ros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+in+bacteria+and+protein+damage+by+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress in bacteria and protein damage by reactive oxygen species.</a> Int Microbiol. 3 (1), 3-8 (2000).</li>
<li>Miethke, M., Marahiel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siderophore-based+iron+acquisition+and+pathogen+control%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Siderophore-based iron acquisition and pathogen control.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 413-451 (2007).</li>
<li>André, A. C., Debande, L., Marteyn, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+selective+advantage+of+facultative+anaerobes+relies+on+their+unique+ability+to+cope+with+changing+oxygen+levels+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The selective advantage of facultative anaerobes relies on their unique ability to cope with changing oxygen levels during infection.</a> Cell Microbiol. 23 (8), e13338(2021).</li>
<li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nutrient+patches+in+planktonic+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).</li>
<li>Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+toward+phytoplankton+drives+organic+matter+partitioning+among+marine+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (6), 1576-1581 (2016).</li>
<li>Taylor, J. R., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trade-offs+of+chemotactic+foraging+in+turbulent+water%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Trade-offs of chemotactic foraging in turbulent water.</a> Science. 338 (6107), 675-679 (2012).</li>
<li>Enfors, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+responses+to+mixing+in+large+scale+bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Physiological responses to mixing in large scale bioreactors.</a> J Biotechnol. 85 (2), 175-185 (2001).</li>
<li>Takors, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale-up+of+microbial+processes%3A+Impacts%2C+tools+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Scale-up of microbial processes: Impacts, tools and open questions.</a> J Biotechnol. 160 (1), 3-9 (2012).</li>
<li>Partridge, J. D., Scott, C., Tang, Y., Poole, R. K., Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+transcriptome+dynamics+during+the+transition+from+anaerobic+to+aerobic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli transcriptome dynamics during the transition from anaerobic to aerobic conditions.</a> J Biol Chem. 281 (38), 27806-27815 (2006).</li>
<li>Ren, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensing+regulation+mechanism+of+Thauera+bacteria+in+simultaneous+nitrogen+and+phosphorus+removal+process%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cleaner+Prod%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensing regulation mechanism of Thauera bacteria in simultaneous nitrogen and phosphorus removal process.</a> J Cleaner Prod. 434, 140332(2024).</li>
<li>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+responds+to+environmental+changes+using+enolasic+degradosomes+and+stabilized+DicF+sRNA+to+alter+cellular+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology.</a> Proc Natl Acad Sci. 114 (38), E8025-E8034 (2017).</li>
<li>Yasid, N. A., Rolfe, M. D., Green, J., Williamson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostasis+of+metabolites+in+Escherichia+coli+on+transition+from+anaerobic+to+aerobic+conditions+and+the+transient+secretion+of+pyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Soc+Open+Sci%22%5BJournal%5D)">Homeostasis of metabolites in Escherichia coli on transition from anaerobic to aerobic conditions and the transient secretion of pyruvate.</a> Royal Soc Open Sci. 3 (8), 160187(2016).</li>
<li>von Wulffen, J., RecogNice-Team,, Sawodny, O., Feuer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+of+an+Anaerobic+Escherichia+coli+Culture+to+Aerobiosis%3A+Balancing+mRNA+and+Protein+Levels+in+a+Demand-Directed+Dynamic+Flux+Balance+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Transition of an Anaerobic Escherichia coli Culture to Aerobiosis: Balancing mRNA and Protein Levels in a Demand-Directed Dynamic Flux Balance Analysis.</a> PloS one. 11 (7), e0158711(2016).</li>
<li>Pedraz, L., Blanco-Cabra, N., Torrents, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradual+adaptation+of+facultative+anaerobic+pathogens+to+microaerobic+and+anaerobic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Gradual adaptation of facultative anaerobic pathogens to microaerobic and anaerobic conditions.</a> FASEB J. 34 (2), 2912-2928 (2020).</li>
<li>Kasahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+microbial+single-cell+growth+dynamics+under+rapid+periodic+oxygen+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Unveiling microbial single-cell growth dynamics under rapid periodic oxygen oscillations.</a> Lab on a Chip. 25, 2234-2246 (2025).</li>
<li>Gruenberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis%3A+fabrication%2C+system+setup%2C+and+operation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560(2013).</li>
<li>Wu, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widefield+frequency+domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+%28FD-FLIM%29+for+accurate+measurement+of+oxygen+gradients+within+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Widefield frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FD-FLIM) for accurate measurement of oxygen gradients within microfluidic devices.</a> Analyst. 144 (11), 3494-3504 (2019).</li>
<li>Kasahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+oxygen-controlled+microfluidic+cultures+for+spatiotemporal+microbial+single-cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enabling oxygen-controlled microfluidic cultures for spatiotemporal microbial single-cell analysis.</a> Front Microbiol. 14, 1198170(2023).</li>
<li>Bisgaard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mixing+performance+in+bioreactors+using+flow-following+sensor+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eng+Res+Des%22%5BJournal%5D)">Characterization of mixing performance in bioreactors using flow-following sensor devices.</a> Chem Eng Res Des. 174, 471-485 (2021).</li>
<li>Nauha, E. K., Kálal, Z., Ali, J. M., Alopaeus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmental+modeling+of+large+stirred+tank+bioreactors+with+high+gas+volume+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eng+J%22%5BJournal%5D)">Compartmental modeling of large stirred tank bioreactors with high gas volume fractions.</a> Chem Eng J. 334, 2319-2334 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Clewin 5</td><td>WieWeb yazılımı, Hollanda</td><td>YOK</td><td>Düzen düzenleyici</td></tr><tr><td>CMOS kamera</td><td>Nikon, Japonya</td><td>DS-Qi2</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camı</td><td>Schott AG, Almanya</td><td>D263 Biyografi</td><td>39,5 mm x 34,5 mm x 0,175 mm</td></tr><tr><td>Femto plazma temizleyici</td><td>Diener Electronics, Almanya</td><td>-</td><td>Çip plazma yapıştırma</td></tr><tr><td>3B Formu</td><td>Formlabs, ABD</td><td>-</td><td>3D yazıcı</td></tr><tr><td>Ömür boyu referans</td><td>Starna Scientific, Birleşik Krallık</td><td>UMM-SFG</td><td></td></tr><tr><td>Kütle akış kontrolörü</td><td>V&ouml; gtlin Instruments GmbH, İsviçre</td><td>GSC-A9SA-BB22 Serisi</td><td>azot, oksijen</td></tr><tr><td>Kütle akış kontrolörü</td><td>V&ouml; gtlin Instruments GmbH, İsviçre</td><td>GSC-A9SA-BB21</td><td>karbondioksit</td></tr><tr><td>Model v3 reçine</td><td>Formlabs, ABD</td><td>RS-F2-DMBE-03</td><td>3D baskı reçinesi</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>3957.1</td><td>LB orta bileşen</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-E 2 fotoğraf makinesi</td><td>Nikon, Japonya</td><td>-</td><td>Ters mikroskop</td></tr><tr><td>pco.flim kamera</td><td>PCO AG, Almanya</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>pco.flim lazer</td><td>Omicron-Laserprodukte GmbH, Almanya</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>8986.1</td><td>LB orta bileşen</td></tr><tr><td>Plan Apo &lambda;</td><td>Nikon, Japonya</td><td>-</td><td>100x yağ, 20x</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS)</td><td>Dow Kimya Şirketi, ABD</td><td>Sylgard 184 Silikon Elastomer Kiti</td><td></td></tr><tr><td>Delme aleti, &Phi; 0,50 mm</td><td>Dünya Hassas Aletler, ABD</td><td>504528</td><td></td></tr><tr><td>Delme aleti, &Phi; 0,75 mm</td><td>Dünya Hassas Aletler, ABD</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Store kriyo şişesi</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks 2016 x64 Sürümü</td><td>Dassault Systems, Fransa</td><td>YOK</td><td>3D CAD</td></tr><tr><td>Yüzey döndürme kaplayıcı</td><td>APT Otomasyon, Almanya</td><td>DÖNDÜRME150i</td><td>PDMS eğirme kaplama</td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>CETONI, Almanya</td><td>neMESYS</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık inkübatörü</td><td>Okolab, İtalya</td><td>-</td><td>Mikroskop ekipmanları</td></tr><tr><td>tris(2,2'-bipiridil)diklororutenyum(II)heksahidrat, (RTDP)</td><td>Acros Organics, Belçika</td><td>208750010</td><td></td></tr><tr><td>Boru</td><td>Saint-Gobain, Fransa</td><td>Tygon F-4040-A</td><td>Gaz giriş boruları</td></tr><tr><td>Boru</td><td>Saint-Gobain, Fransa</td><td>Tygon AAD04103</td><td>Akışkan boruları</td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Carl Roth, Almanya</td><td>2363.3</td><td>LB orta bileşen</td></tr></tbody></table>

mikroakışkan Çift katmanlı cihaz kullanarak mikrobiyal tek hücreli büyüme analizinde hızlı oksijen salınımları oluşturma

Creating Rapid Oxygen Oscillations in Microbial Single-cell Growth Analysis using a Microfluidic Double-layer Device

PDMS çift katmanlı çip imalatı Fabrikasyon çift katmanlı çip, görselleştirme için renkli gaz kanalları (kırmızı) ve sıvı kanalları (mavi) ile Şekil 2A'da gösterilmiştir. Çip, paralel deneylere izin vermek için üç özdeş sıvı kanalına ve üst üste binen gaz kanallarına sahiptir. Akışkan kanalı, bir dizi yetiştirme odasına sahip bir yetiştirme alanına sahiptir (Şekil 2A(i)). Hücreler yetiştirme odalarının içinde hapsedilir ve tek katmanlı bir formatta büyümelerine izin verilir, bu da yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış görüntüleme ve yüksek görüntü elde etme oranı sağlar. Çipin enine kesiti, 3 mm kalınlığında bir üst katmanı ve 65 μm kalınlığında bir alt katmanı gösterir ve ara PDMS membranı aracılığıyla gaz kanalından sıvı kanalına hızlı gaz difüzyonu sağlar (Şekil 2A (ii-ii')).
Çip üzerinde oksijen kontrolü Geliştirilen çipin gaz değişim kabiliyeti, FLIM ve oksijene duyarlı boya15 kullanılarak test edildi. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, sıvı kanalındaki oksijen konsantrasyonu, oksijen konsantrasyonu ! ile %0 arasında kaydırıldığında onlarca saniye içinde ya karşılık gelen bir azalma ya da artış gösterdi. Bu oksijen ölçüm sonuçları, onlarca saniye içinde hızlı oksijen salınımının, geliştirilen çift katmanlı mikroakışkan çipte tekrarlanabileceğini göstermektedir.
Sabit oksijen koşulları altında mikrobiyal yetiştirme Çip ilk olarak, çeşitli oksijen konsantrasyonları ile sabit gaz koşulları altında fakültatif anaerob E. coli büyümesini karakterize etmek için kullanıldı. Ön deneylerde karbondioksit tükenmesi altında E. coli'nin sınırlı büyümesini gözlemlediğimiz için (veriler gösterilmemiştir) her zaman besleme gazına karbondioksit eklenmiştir. Şekil 3A ve Şekil 3B, sırasıyla aerobik (! oksijen kaynağı) ve anaerobik (%0 oksijen kaynağı) koşullar altında E. coli'nin temsili faz kontrast görüntülerini göstermektedir. 3 saatlik ekimden sonra, aerobik koşullar altında yetiştirilen E. coli, anaerobik koşullara kıyasla daha büyük kolonilerle sonuçlandı. Kantitatif analiz ayrıca, Şekil 3C'deki büyüme eğrilerinde gösterildiği gibi, oksijen mevcudiyetine bağlı olarak koloni büyüklüğünde (Akolonisi) farklı artış oranlarını gösterir. Birkoloninin, farklı koloniler ve koşullar üzerinde karşılaştırmaya izin vermek için başlangıç alanına göre normalleştirildiğini unutmayın. Üstel büyüme oranı μ, büyüme eğrisinden aşağıdaki gibi belirlenebilir ve Şekil 3D'de özetlenebilir.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68697/68697eq2.jpg">
Sonuçlar, cihazın hedeflenen konsantrasyonlarda oksijeni kontrol etme ve elde edilen hızlandırılmış görüntülerden karşılık gelen mikrobiyal büyümeyi etkili bir şekilde analiz etme yeteneğini doğrular.
Salınımlı oksijen koşulları altında mikrobiyal yetiştirme Son olarak, E. coli, salınımlı oksijen koşulları altında, aerobik ve anaerobik gazlama fazları arasında bir anahtarlama aralığı T' ile geçiş yapılarak yetiştirildi. Salınımlı oksijen koşullarıyla bağlantılı olarak zamana bağlı büyüme analizi yeteneğini test etmek için 60 dakika ile 1 dakika arasında çeşitli T'ler incelendi. Şekil 4, T' = 60, 30, 10, 5, 2 ve 1 dakika ile salınımlı oksijen koşulları altında niceliksel E. coli büyümesini göstermektedir. Akolonisine dayalı büyüme eğrisine ek olarak, Δt'μ anlık büyüme hızı da aşağıdaki gibi zamana bağlı içgörüler elde etmek için belirlenir.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/68697/68697eq3.jpg">
Sabit aerobik ve anaerobik koşullar altındaki büyüme oranları da büyüme referansları olarak Şekil 4'te noktalı çizgilerle (%21, μ μ%0) gösterilmiştir. E. coli büyümesi, salınımlı gaz koşullarına yanıt olarak farklı dinamikler sundu. Örneğin, gazlama fazı aerobik koşullardan anaerobik koşullara geçirildikten sonra (T' = 60 dakika), büyüme (i) tepki fazı: büyüme hızında ani düşüş, ardından (ii) toparlanma fazı: büyüme hızında kademeli artış ve (iii) stabilizasyon fazı: %μ 0 civarında büyüme stabilizasyonu. E. coli büyüme dinamikleri, 1 dakika gibi kısa bir sürede çeşitli T'ler altında zamansal olarak başarılı bir şekilde çözüldü, burada E. coli, büyümeyi değişen gaz koşullarına adapte etmek için sınırlı süre nedeniyle yukarı ve aşağı monoton bir büyüme hızı gösterdi. Ayrıca, büyüme davranışı sadece koloni düzeyinde değil, aynı zamanda tek hücre düzeyinde de analiz edilebilir. Şekil 5, çeşitli anahtarlama aralıklarında T' oksijen salınımları altında tek hücreli alanın gelişimini göstermektedir. Tek hücreli büyüme, izleme analizi olmadan komşu grafikleri takip ederek çıkarılabilir. Tek hücre düzeyindeki büyüme davranışı, Şekil 4'teki koloni düzeyinde gözlemlenene benzer; aerobik gazlama fazı sırasında daha hızlı bir alan artışı ve gaz değiştirme olayında büyüme hızında net bir değişiklik. Buradaki sonuçlar, salınımlı gaz koşulları altında mikropları yetiştirme ve mikrobiyal büyümeyi oksijen mevcudiyeti ile ilişkili olarak zamana bağlı bir şekilde analiz etme yeteneğini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68697/68697fig1.jpg"> 
Şekil 1: Çift katmanlı çip üretim prosedürü. Prosedür (A, C) kalıp tasarımı, (B, D) kalıp imalatı, (EG) PDMS kalıplama ve (H) çip montajı ile başlar. Bu rakam15'ten değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68697/68697fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68697/68697fig2.jpg"> 
Şekil 2: Fabrikasyon çift katmanlı çip ve oksijen kontrol kabiliyeti. (A) Görselleştirme için renkli gaz kanalları (kırmızı) ve sıvı kanalları (mavi) içeren fabrikasyon çipin temsili görüntüsü sunulur. SEM görüntüsü, her iki taraftaki sıvı kanallarına bağlı bir dizi yetiştirme odasını gösteren (i) 'de gösterilmiştir (ölçek çubuğu 100 μm). Çipin enine kesiti, 3 mm kalınlığındaki üst katmanı ve 65 μm kalınlığındaki alt katmanı gösteren (ii-ii') ile gösterilmiştir. (B) Aerobik (! oksijen) ve anaerobik (%0 oksijen) koşullar arasında geçiş yapıldıktan sonra sıvı kanalında ölçülen oksijen konsantrasyonu. Bu rakam15'ten değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68697/68697fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68697/68697fig3.jpg"> 
Şekil 3: Sabit oksijen koşulları altında E. coli yetiştiriciliği. (A) Hücreler 3 saat boyunca aerobik olarak (% 21 oksijen kaynağı) yetiştirilir ve faz kontrast mikroskobu kullanılarak hızlandırılmış görüntüler elde edilir. (B) Hücreler anaerobik olarak yetiştirilir (%0 oksijen kaynağı) ve 3 saat boyunca hızlandırılmış görüntüler elde edilir. (C) Çeşitli sabit oksijen koşulları altında hücre büyümesi, Akolonisine dayalı olarak çizilir. (D) Üstel büyüme oranı hesaplanır ve özetlenir. Tüm ölçek çubukları = 5 μm. Veriler ortalama ± S.D. n = 35 koloni (%0), 27 (%0.1), 21 (%0.5), 16 (%1), 13 (%5), 13 (), 29 (!) olarak ifade edilmiştir. Bu rakam15'ten değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68697/68697fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68697/68697fig4.jpg"> 
Şekil 4: Salınımlı oksijen koşulları altında E. coli yetiştiriciliği. Çeşitli salınımlı oksijen koşulları altında hücre büyümesi incelenir (T', aerobik ve anaerobik koşullar arasındaki geçiş aralığı). Akolonisine dayalı hücre büyümesi zaman içinde çizilir (üstte) ve μ Δt, zamanla çözülmüş veri yorumlamasına izin vermek için zaman içinde çizilir (altta). Veriler ortalama ± S.D. n = 5 koloni (60 dk), 3 (30 dk), 4 (10 dk), 4 (5 dk), 4 (2 dk), 5 (1 dk) olarak ifade edilmiştir. Bu rakam15'ten değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68697/68697fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68697/68697fig5.jpg"> 
Şekil 5: Salınımlı oksijen koşulları altında yetiştirilen E. coli'nin tek hücreli alanı (tek hücreli ). Veriler, her bir anahtarlama aralığı T'den temsili bir koloniden alınmıştır. Bu rakam15'ten değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68697/68697fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Mikroakışkan Çift Katmanlı Cihaz Kullanarak Mikrobiyal Tek Hücreli Büyüme Analizinde Hızlı Oksijen Salınımları Oluşturma

Microbial single-cell analysis using microfluidics coupled with time-lapse microscopy holds promise for investigating microbial growth behavior under ...

creating-rapid-oxygen-oscillations-microbial-single-cell-growth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

6 plaka mekansal ve zamansal oksijenasyonu üzerinden gelişmiş kontrol imkanı sağlayan bir add-on bir platform imalatı ve doğrulama. Cihaz bir dizi kültür sistemleri uyarlanabilir ve yara iyileşmesi üzerine oksijen etkilerini araştırmak amacıyla kullanılabilir.

İmalat ve Operasyon yapışkan Hücresel Kültürler Oksijen Ekle

Mikroakışkan cihazlar gerçek zamanlı olarak ve uygun fiziksel ölçeklerde karmaşık doğal süreçler görselleştirmek için kullanılabilir. Biz yeraltı bakteri büyüme ve taşımacılık eğitimi için doğal gözenekli ortamın temel özellikleri taklit basit bir mikroakışkan cihaz geliştirdik.

Gözenekli Ortam Mikrobiyal Ulaştırma incelenmesi için basit mikroakışkan Sistemleri: Mikrodünya Pencere

Biz temiz oda ya da yumuşak litografi gerek kalmadan, birden çok farklı suşları için benzer dinamik koşullar uygulanarak yeteneğine microfluidic cihazlar üretmek için basit bir yöntem sunulmaktadır.

Birden Farklı Suşlarının incelenmesi için bir mikroakışkan Cihazı

Kaynak: Pioli, R., ve diğerleri, Sıralı Kılcallık Destekli Montaj Yoluyla Mikroorganizmaların ve Mikropartiküllerin Modellenmesi. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, karbonsuz bir süspansiyon ve kontrollü akış kullanarak mikroakışkan tuzaklarda tek floresan etiketli Escherichia coli (E. coli) hücrelerini yakalama yöntemini ve ardından mikrokolonilerin büyümesini ve floresan görüntülemesini tetiklemek için besin ilavesini göstermektedir.

Tek Hücreli Bakteri Büyümesinin Mikroakışkan Desenleme ve Floresan Tabanlı İzlenmesi

Kaynak: Jian, X. ve diğerleri, Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür Sistemi (MMC) Kullanılarak Otomatik Mikrobiyal Yetiştirme ve Uyarlanabilir Evrim. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, bakteri üremesinin gerçek zamanlı izlenmesi için mikroakışkan damlacık tabanlı bir platformun kullanımını göstermektedir. Sistem, bakteriyel süspansiyonlar içeren tekdüze damlacıklar üreterek ve bunları bir algılama yolu boyunca yönlendirerek, bir büyüme eğrisi oluşturmak için hücre yoğunluğunun sürekli optik ölçümüne...

Mikroakışkan Mikrodamlacık Kültür Sistemi Kullanarak Bakteri Büyümesinin Gerçek Zamanlı İzlenmesi

Kaynak: Cabeen, M. T. ve diğerleri. Bacillus subtilis'in Tek Hücreli Mikrofluidik Analizi. J. Vis. Exp. (2018)Video, tek hücre düzeyinde bakteri büyümesini gözlemlemek için mikrofluidik bir cihazın kullanıldığını gösteriyor. Mikro ölçekli hendeklerde hapsedilmiş hareketsiz bakteriyel hücrelerin sürekli olarak floresan mikroskobu altında nasıl görüntülendiğini ve beslendiğini gösteriyor. Bu kurulum, hücre bölünmesi ve soy takibinin birden fazla nesil boyunca gerçek zamanlı görselleştirilmesini...

Mikrofluidik bir sistemde tek hücre çözünürlüğünde bakteri büyümesini takip etmek

Bu protokolde, prokaryotik mikroorganizmaların tek hücreli analizi için bir mikroakışkan pikolitre biyoreaktörün (PLBR) üretimi, kurulumu ve temel çalışması tanıtılmaktadır. Endüstriyel olarak ilgili mikroorganizmalar, geleneksel yöntemlerle neredeyse imkansız olan, belirli zaman dilimlerinde büyüme hızı, morfoloji ve fenotipik heterojenlik hakkında bilgi sahibi olmaya izin veren ilke kanıtı olarak analiz edildi.

Mikrobiyal Tek Hücreli Analiz için Mikroakışkan Pikolitre Biyoreaktör: Fabrikasyon, Sistem Kurulumu ve Çalışması

Kimyasal ve oksijen gradyanlarının kontrolü hücre kültürleri için esastır. Bu makale, hücre göçü çalışmaları için kimyasal ve oksijen gradyanlarının kombinasyonlarını güvenilir bir şekilde üretebilen ve karmaşık enstrümantasyon olmadan biyolojik laboratuvarlarda pratik olarak kullanılabilen bir polidimetilsiloksan-polikarbonat (PDMS-PC) mikroakışkan cihazını bildirmektedir.

Hücre Göç Çalışmaları altında Dik Kimya ve Oksijen Gradyanların için polidimetilsiloksan-polikarbonat mikroakışkan Cihazlar

Biz örnek olarak Bacillus subtilis kullanarak bireysel bakteri hücre soy mikrosıvısal çözümlenmesi için bir yöntem mevcut. Yöntemi gözlem, hücre nesiller sıkı bir şekilde kontrol edilebilir ve düzgün büyüme koşullar altında yüzlerce izin vererek Mikrobiyoloji geleneksel analitik yöntemleri eksikliklerin üstesinden gelir.

Bacillus subtilis tek hücreli mikrosıvısal analizi

PdMS tabanlı, çok katmanlı, mikroakışkan bir cihazın in vitro transkripsiyon ve çeviri (IVTT) reaksiyonlarının uzun süreler boyunca gerçekleştirilmesine olanak sağlayan üretim süreci anlatılmaktadır. Ayrıca, bu reaksiyonları uzun süre ler boyunca otomatikleştirmek ve korumak için gereken donanım ve yazılıma kapsamlı bir genel bakış sağlanır.

Uzun Süreli Hücresiz Gen Ekspresyonunun İletimi için Çok Katmanlı Mikroakışkan Platform

Protokol, standart bir floresan mikroskobunda oksijenasyonlarının ve hücre ölümlerinin çok parametrik analizini kullanarak biyobaskı için yüksek verimli sferoid üretimini tanımlar. Bu yaklaşım, sferoidlerin yaşayabilirliğini kontrol etmek ve 3D doku, tümör mikroçevresi ve başarılı (mikro) doku biyofabrikasyonunun modellenmesinde önemli olan standardizasyonu gerçekleştirmek için uygulanabilir.

Çok Hücreli Sferoidlerin Uygun Fiyatlı Oksijen Mikroskobu Destekli Biyofabrikasyonu

Öğrenin, çift katmanlı mikroakışkan cihaz kullanarak mikrobiyal tek hücreli büyüme analizinde hızlı oksijen salınımlarını nasıl oluşturacağınızı. Bu yöntem, oksijen değişimlerine karşı mikrobiyal tepkileri incelemek için güvenilir bir platform sunar.

Mikroakışkan Çift Katmanlı Cihaz Kullanarak Mikrobiyal Tek Hücreli Büyüme Analizinde Hızlı Oksijen Salınımları Oluşturma

Daha fazla video keşfet