Tümör Hücrelerinin Tip 1 Konvansiyonel Dendritik Hücre Benzeri Hücrelere İzlenebilir İn Vivo Yeniden Programlanması

Yeni bir immünoterapi stratejisi olarak kanser hücrelerinin cDC1 benzeri hücrelere in vivo programlanmasını araştırıyoruz. Bu yaklaşımın immün soğuk tümörleri immün sıcağa dönüştürüp dönüştüremeyeceğini belirlemeyi ve böylece anti-tümör bağışıklığını duyurmayı amaçlıyoruz. Kanser hücrelerini doğrudan tümör içinde immünojenik cDC1 benzeri hücrelere dönüştürmek için bir protokol sunarak mevcut in vivo cDC1 üretim stratejilerinin sınırlamalarını ele alıyoruz ve cDC1 güdümlü bağışıklık tepkilerinin yerinde incelenmesini sağlıyoruz.

İzlenebilir in vivo programlama protokolümüz, baskılayıcı tümör mikro ortamının üstesinden gelerek olgun immünojenik cDC1 benzeri hücreleri güvenilir bir şekilde üretir ve bu hücreler doğrudan in vivo olarak üretildiğinden, bu yaklaşım in vitro bağışıklık hücresi üretimine olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Bulgularımız, in vivo transkripsiyon faktörü aracılı yeniden programlamanın kliniğe çevrilmesi için bir temel oluşturuyor ve dayanıklı anti-tümör bağışıklık tepkilerini ortaya çıkaran kullanıma hazır, ancak kişiselleştirilmiş kanser immünoterapisini tanıtıyor. İleriye dönük olarak, cDC1 benzeri hücrelerin yeniden programlanmasının üçüncül ve altyapı oluşumunu nasıl ortaya çıkarabileceğini ve bunun humoral bağışıklığa dönüşüp dönüşmediğini araştırıyoruz.

Ek olarak, diğer immünoterapötik yaklaşımlarla potansiyel sinerjisini de araştırıyoruz. Başlamak için, HEK 293T hücrelerini %70 ila 80 birleşmeye ulaşana kadar kültürleyin. Şimdi, transfer plazmitini içeren hazırlanan transfeksiyon karışımını bir dakika boyunca iyice vorteksleyin ve DNA lipid kompleksi oluşumuna izin vermek için karışımı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Ortamı HEK 293T hücrelerinden aspire edin ve penisilin streptomisin içermeyen ve %10 FBS ile desteklenmiş 10 mililitre DMEM ekleyin. Daha sonra transfeksiyon karışımını damla damla 150 milimetrelik plakalara ekleyin ve %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 16 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı bir milimolar sodyum bütirat ile desteklenmiş 20 mililitre DMEM tam ortamı ile değiştirin ve hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ile inkübe edin.

Daha sonra, lentivirüs içeren süpernatanı transfeksiyondan 48 ve 60 saat sonra 50 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. İlk toplamadan sonra, ikinci hasat için 150 milimetrelik plaka başına 12 mililitre önceden ısıtılmış tam DMEM ekleyin. Toplanan sıvıyı 0,45 mikrometrelik, düşük protein bağlayıcı polietersülfon filtreden geçirin.

37 gram lentivirüs içeren besiyerini 38,5 mililitrelik üstü açık ince duvarlı polipropilen tüplere pipetleyin. Tüpleri sallanan bir kova rotorunda 25.000 G'de dört santigrat derecede 90 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, peleti bozmadan süpernatanı aspire edin.

Fazla sıvıyı boşaltmak ve peleti kurutmak için üstü açık ince duvarlı polipropilen tüpleri bir laboratuvar mendili veya benzeri emici malzeme üzerine beş dakika boyunca baş aşağı yerleştirin. Daha sonra, her pelete HEPES veya PBS ile desteklenmiş 200 mikrolitre buz gibi soğuk DMEM ekleyin ve karışımı 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirilmiş bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tamamen yeniden süspansiyona izin vermek için peleti gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Tüm yeniden süspanse edilmiş peletleri tek bir kapta birleştirin, viral stoğu 50 ila 200 mikrolitre arasında daha küçük hacimlere ayırın ve uzun süreli kullanım için eksi 80 santigrat derecede saklayın. Kanser hücresi genişlemesinden sonra, üçüncü günde EGFP pozitif ve EGFP negatif hücrelere yakın bire bir oranını elde etmek için hücre süspansiyonlarını transdüksiyon için hazırlayın. Hücre süspansiyonuna mililitre polibren başına sekiz mikrogram ve ardından daha önce belirlendiği gibi uygun hacimde lentivirüs ekleyin.

İçeriği kabarcık oluşturmadan yavaşça karıştırın. Şimdi, altı oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna bir çarpı 10 ila beş hücre gücü içeren hazırlanmış hücre süspansiyonunun iki mililitresini pipetleyin ve %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. 24 saat sonra, lentivirüs içeren ortamı her kuyucuktan çıkarın.

Kuyuları PBS ile iki kez yıkayın. Her oyuğa 500 mikrolitre tripsin ekleyin ve %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücrenin plakadan tamamen ayrıldığını doğrulamak için kuyucukları ışık mikroskobu altında inceleyin.

Ardından, tam ortam kullanarak hücreleri 50 mililitrelik konik tüplere toplayın. Hücreleri peletlemek için 350 G'de beş dakika santrifüjleyin. Peleti PBS ile yıkayın.

Bir alikot alın ve bir hemositometre ve tripan mavisi boyama kullanarak canlı hücre sayısını değerlendirin. Daha sonra, tümör başına 50 mikrolitrede altı hücrenin gücüne karşılık gelen, mililitrede yedi hücrenin gücüne iki ila dört çarpı 10 üzeri 10'luk bir konsantrasyon elde etmek için son hücre peletini buz gibi soğuk PBS'de yeniden süspanse edin. Hücreleri buzun üzerine yerleştirin ve hayvan deney alanına taşıyın.

CD45.1 fareyi uyuşturduktan sonra, hipotermiyi önlemek için bir ısıtma pedinin üzerine yerleştirin. Anestezi sırasında oküler dehidrasyonu önlemek için fareye göz kremi uygulayın. Bir tıraş bıçağı kullanarak farenin sağ tarafını tıraş edin.

İsteğe bağlı olarak, fareyi bir kulak kesme makinesiyle işaretleyin. Tıraş edilen bölgeyi dezenfekte edin ve kalan tüyleri %70 etanole batırılmış bir çubukla alın. Şimdi, bir P1000 pipeti kullanarak kanser hücrelerini iyice yeniden süspanse edin.

Tamamen yeniden süspanse edilmiş hücre süspansiyonunu, 30 gauge iğne ile donatılmış 0,5 mililitrelik bir şırıngaya yükleyin. İki parmağınızı kullanarak farenin traş edilmiş tarafındaki cildi nazikçe kaldırın ve şırınga iğnesinin ucunu kaldırılan cildin oluşturduğu kıvrıma sokun. Şırıngayı bir elinizle yerinde tutarken kaldırılmış cildi serbest bırakın.

Diğer elinizi iki parmağınızla cilt üstünü germek için kullanın. Enjeksiyon bölgesinde görünür oval şekilli bir deri altı şişlik oluşturmak için 50 mikrolitre kanser hücresi süspansiyonunu yavaşça enjekte edin. Enjeksiyon prosedüründen sonra, hayatta kalmasını sağlamak için hayvanı anesteziden tamamen uyanana kadar izleyin.

SFFV-PIB-eGFP plazmidi ile transfekte edilen HEK 293T hücreleri, transfeksiyondan 24 saat sonra net eGFP ekspresyonu göstererek başarılı plazma iletimini doğruladı. Transdüksiyondan 72 saat sonra, melanom hücreleri yeniden programlama faktörlerinin ve eGFP'nin başarılı bir şekilde verildiğini gösterdi. Hücrelerin implantasyonundan sonraki dokuzuncu günde, in vivo yeniden programlama, in vitro koşullara göre daha yüksek oranda tamamen yeniden programlanmış CD45-pozitif, MHC-II-pozitif, cDC1-benzeri hücreler verdi.

İmplantasyondan sonraki üçüncü günde, PIB-eGFP tümörleri, eGFP kontrollerine göre belirgin şekilde daha yüksek CD45-pozitif immün hücre infiltrasyonu gösterdi ve bu da erken immün yeniden şekillenmeyi gösterdi. Dokuzuncu günde, tümör alanı başına CD45 ortalama floresan yoğunluğu, PIB-eGFP tümörlerinde kontrollere göre önemli ölçüde daha yüksek kaldı. Üçüncül lenfoid yapılar, dokuzuncu günde PIB-eGFP tümörlerinde saptanabilir hale geldi ve bu, tümör mikroçevresindeki yapısal immün değişiklikleri gösterdi.