Yüksek Dereceli Seröz Over Karsinomu Modellemesi için Fallop Tüpü Epitel Hücrelerinden Fare Kaynaklı Organoid Hatların Geliştirilmesi

Evet, şu anda protokolün özetlediği anlamda senjenik olan yüksek dereceli seroz yumurtalık karsinomu yeni modelleri geliştirmek üzerinde çalışıyoruz. Sağlıklı farelerden alınan sağlıklı fallop tüplerini alıp Petri kabında organoid olarak türetiyoruz ve onlara normal insan versiyonunda bulunan farklı hataları veya genetik modifikasyonları veriyoruz. Bu çok güzel çünkü bir yandan, Petri kabındaki tümörlerin her türlü içsel faktörünü organoid olarak inceleyebilirsiniz; bunlar geleneksel 2B kültürlerden daha gerçekçidir.

Ama mesele şu ki, senjenik modeller olduğu için, bu organoidleri alıp tekrar bir fareye koyabilirsiniz ve tümörün nasıl geliştiğini ve konakla nasıl etkileşime girdiğini görebilirsiniz. Bu, tümörün ve tümörüjenezin nasıl gerçekleştiğine dair çok daha bütüncül bir bakış açısına sahip olmamıza olanak tanıyor; umuyoruz ki bu bize çok daha iyi araçlar ve hastalığın nasıl işlediğini, nasıl mücadele edeceğimizi daha iyi anlamamızı sağlar. Başlamak için, ötenazi edilmiş dişi C57 siyah 6J fareleri edinin.

Yumurtalık ve fallop tüpünü çıkarıp DMEM içeren steril bir Petri kabına aktarın; bu kapta dört derece Celsius'ta penisilin streptomisin takviyesi yapıldı. Yumurtalıktan kalan yağları çıkarmak için bir diseksiyon mikroskobu, ince forseps ve makas kullanın. Yumurtalık ve rahmden fallop tüpünü, infundibulum ve distal ampulla'nın bir kısmını izole edin.

Şimdi temizlenmiş dokuyu tam sindirim karışımını içeren bir tüpe aktarın. İnce bir makasla fallop tüpünü 0,5 milimetreden küçük parçalara doğra. Sonra tüpü 37 derece Celsius'ta 40-50 dakika kuluçka edin, ardından organoid kültürleme işlemi yapıldı.

Fare tümörü modelini geliştirmek için, her biri dört milyon hücre içeren beş enjeksiyon kuruldu; bu hücre takviyesiz Opti-MEM I, buz gibi soğuk bir bazal zar matrisinde yeniden süspansiyon yapıldı. Enjeksiyonları hazırlamak için, önce soğuk PBS ile 28 kalibre iğne ile donatılmış U-100 insülin şırıngasının ölü hacminden hava kabarcıkları dışarı çıkarılır. Sonra şırıngaya yavaşça 40 mikrolitre hücre yükleyin ve yüklü enjektörleri fareler anestezi edilene kadar buzda tutun.

Enjeksiyona hazır olunca, şırıngaları bir ısıtma lambasının yanına koyun, böylece taban membran matrisi ısınıp viskoziteyi artırarak enjeksiyon ve aşılama kolaylaşır. Sonra, ameliyata hazırlanmak için bir fareyi önceden ısıtılmış bir kafese bir ısıtma lambasının altına yerleştirin. Anestezi edilmiş bir farenin boyunun üstünde, yan kısmı boyunca bir santimetreden kısa bir kesi yapın.

Epidermis ve hipodermisi keserek bursa bölgesine ulaşın. Bağlı yağ pedini bularak yumurtalığı nazikçe çekin. Hazırlanmış bir şırıngayı kullanarak hücreleri yağ pedinden ve yumurtalıktan oviduct kesesine enjekte edin.

Yumurtalığı dikkatlice bursaya geri döndürün. Kas katmanını örgülü olmayan dikişlerle kapatın. Daha sonra, cilt kesisini cerrahi zımba kullanarak kapatın.

Faresi tekrar ısıtılmış kafese yerleştirin ve vücut sıcaklığını bir ısıtma lambasıyla yarı bilinçli hale gelene kadar genellikle 15 dakikadan fazla koruyun. Farelerin fallop tüpü epitelinden türetilen organoidler, yaklaşık beş gün sonra iyi tanımlanmış küresel ve net bir şekle sahip olur ve 10-12. gün civarında paketlenmeyi gerektirir. Vahşi tip organoidler, lentiviral veya retroviral gen aşırı ekspresyonu gibi genetik mühendislik teknikleriyle kanser önleyici tümörlere dönüştürülür.

Genetik olarak değiştirilmiş organoidlerden türetilen tek klon hücre hatları, in vivo yumurtalık bursasına enjeksiyon yoluyla daha fazla incelenebilir. Tümörler genellikle enjeksiyondan yaklaşık 60 gün sonra iki ila üç santimetre boyuta ulaşır. Aslında, daha önce belirttiğim gibi, bu protokolün çalışma şeklinin en büyük avantajı tabii ki senjenjenik modeller üretmektir, değil mi?

Ve bu yüzden senjenikler olduğu için, daha önce de söylediğim gibi, tam bir hayvan, tam bir fare ile geliştirdiğiniz tümör arasındaki etkileşimi gerçekten takdir edebilirsiniz; tümörün genetiği üzerinde tam kontrole sahip olabilirsiniz. Ve tabii ki, Petri kabının içindeki bağışıklık sistemini anlamaya çalışacağınız diğer modellerle karşılaştırıldığında, Petri kabındaki bağışıklık sistemini taklit etmek çok zor olacak. Ya da PDX'ler, yani hastalardan alınan tümör örneklerini alıp farelere koyarsanız, bunun çalışması için farelerin bağışıklık sistemi olamaz, yoksa bu tümörü reddeder, değil mi?

Ancak bu model senjenik olduğu için, tüm konak ile tümör ve özellikle bağışıklık sistemi ile etkileşimini gerçekten takdir edebilirsiniz; bu da şu anda alandaki en popüler araştırma alanlarından biri. Bu yüzden bence bu protokolün diğer protokollere kıyasla en önemli avantajı bu. Aslında, bu modelleri çok ilginç bazı olayları araştırmak için zaten kullanıyoruz.

Şu anda en çok ilgilendiğim şey, adaptif bağışıklık sisteminin genomik özellikleri, özellikle yüksek dereceli seroz yumurtalık karsinomlarının kopya sayı varyasyonlarını şekillendirmesinde önemli bir katkı sağladığıdır; çünkü bağışıklık sistemi yoksa, bu tümörlerin bu kadar büyük ve karmaşık DNA yeniden düzenlemeleri geliştirmediği anlaşılıyor. Bu yüzden bunun nasıl gerçekleştiğini ve umarız bunu nasıl tersine çevirebileceğimizi ve buna karşı herhangi bir bağışıklık tedavisini güçlendirebileceğimizi umuyoruz.