Xenotransplantasyonda akut hücresel ve antikor aracılı reddi incelemek için üç kişilik iş akışına sahip standartlaştırılmış bir fare modeli

Araştırmalarımız, akut hücresel ve antikor aracılı reddetme mekanizmalarını incelemek amacıyla standartlaştırılmış küçük hayvan ksenotransplantasyon modellerine odaklanmaktadır. Mevcut modeller sıklıkla operatör değişkenliğinden ve akciğer prosedürlerinden kaynaklanan sorunlar yaşamaktadır. Bu protokol; hızlı, standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir iş akışı sunmaktadır.

Bu şekil, operatörlerin alıcı hazırlığı, donör kalp temini ve donör kalp anastomozunu eş zamanlı olarak gerçekleştirdiği, fare ksenotransplantasyonu için standartlaştırılmış üç kişilik iş akışını göstermektedir. Başlamak için, 10 ila 12 günlük neonatal sprayed dolly sıçanlar ile yedi ila sekiz haftalık C57 Black six veya BALB/c fareler temin edin. Tüm donör sıçanları ve alıcı fareleri spesifik patojensiz bir ortamda barındırın.

Anestezize edilmiş sıçanın torakoabdominal bölgesini povidon iyot emdirilmiş pamuk topları ile dezenfekte edin. Karın bölgesini makasla kesin. Ardından, vena cava inferioru açığa çıkarmak için bağırsakları bir pamuklu çubuk yardımıyla nazikçe kenara çekin.

İnferior vena cava'ya 0.2 ile 0.5 mililitre heparinli salin enjekte etmek için bir insülin enjektörü kullanın. Kanamayı önlemek için enjeksiyon bölgesini bir pamukla hafifçe sıkıştırın. Diyaframı insize edin.

Göğüs duvarını bilateral olarak kesin ve kalbi tamamen açığa çıkarmak için geri çekin. Ardından, baskıyı azaltmak için timusu çıkarın ve vena cava superior'u kesin. Kardiyak arrest indüklemek için aortaya bir mililitre University of Wisconsin solüsyonu perfüze edin.

Kalp kırmızı renkten soluk renge dönene kadar perfüzyona devam edin. Kalbin sıcaklığını düşürmek ve dehidrasyonu önlemek için üzerine buz gibi soğuk salinle ıslatılmış bir gazlı bez yerleştirin. Superior ve inferior vena cava'yı 8.0 ipek sütür ile bağlayın.

Her iki damarı da kesin. Ardından aortayı aortik arkus seviyesinden kesin. Pulmoner arteri bifurkasyon noktasından kesin.

Tüm pulmoner venleri 8-O ipek sütür ile bağlayın. Ardından donör kalbini çıkarın. Hasat edilen kalbi, geçici koruma için buz gibi soğuk salin içerisine yerleştirin.

Anestezize edilmiş alıcı farenin boyun bölgesindeki tüyleri bir tüy dökücü krem kullanarak temizleyin. Cildi, povidone iyot ve alkol ile sırasıyla üçer kez silerek dezenfekte edin. Cerrahi bir bistüri ile boyun bölgesinde, orta hattın yaklaşık bir santimetre sağından iki santimetrelik boyuna bir insizyon yapın.

Subkütan yağ ve kas tabakalarını temizlemek için künt diseksiyon uygulayın. Submandibular bezi eksize edin. Eksternal juguler veni açığa çıkardıktan sonra, dalları tek tek koterize etmek için düşük koagülasyon moduna ayarlanmış bir elektrokoter kalemi kullanın.

Ligasyon için venin distal ucuna yakın iki adet 8.0 ipek sütur yerleştirin. Ardından, iki ligatür arasından eksternal juguler veni mikrocerrahi makas kullanarak kesin. Eksternal juguler veni venöz manşetin içine yerleştirin ve manşeti venin tabanına doğru itin.

Ardından vasküler klemple sabitleyin. Ligatürleri çıkarmak için mikrocerrahi makas kullanın. Sonra, damardaki kalıntı kanı heparinize salin kullanarak yıkayın.

Bir çift mikrocerrahi pens yardımıyla, eksternal juguler veni manşetin üzerine evert edin ve 8.0 ipek sütür ile sabitleyin. Karotis kılıfını bulmak için sternokleidomastoid kasın posteriorunda künt diseksiyon gerçekleştirin. Karotis kılıfını açın.

Ortak karotis arteri, internal juguler ven ve vagus sinirinden dikkatlice ayırın. Ardından, karotis arterini bağlayıp kesin. Daha sonra, kesilen arterin alt ucunu arteriyel manşetin içinden geçirin.

Arteri manşet üzerinden ters çevirin ve yerine sabitleyin. Donör aortu, alıcının karotis arteri üzerindeki arteriyel manşetin üzerine geçirin. 8.0 ipek ligatür ile sabitleyin.

Donör pulmoner arter etrafına gevşek bir düğüm döngüsü oluşturun. Pulmoner arteri, alıcının eksternal juguler veni üzerindeki venöz manşetin üzerine geçirin. Ardından, ipek ligatür ile sabitleyin.

Kan akışını yeniden sağlamak için alıcının karotis arteri ve eksternal juguler ven üzerindeki vasküler klempleri serbest bırakın. Donör kalbin güçlü kontraksiyonlara yeniden başladığını ve 10 saniye içinde hızla kırmızıya döndüğünü gözlemleyin. Donör kalp stabil bir ritim kazandığında, konumunu ayarlayın.

4.0 sütürler kullanarak boyundaki deri insizyonunu kapatın. Cerrahi bölgeyi povidon iyot ile dezenfekte edin. Vücut sıcaklığını korumak için fareyi 37 ile 38 °C arasında tutulan sıcak, yumuşak bir pedin üzerine yerleştirin.

Fare bilinci yerine gelene kadar izleyin. Tamamen uyandığında, fareyi yiyecek ve suya yeterli erişimi olan bir kafeste tek başına barındırın. BALB/c alıcılarında medyan greft sağkalım süresi dört gündür.

C57 Black 6 alıcılarında ise bu süre anlamlı şekilde 6,5 güne uzamıştır. SD-BALB/c grubunda, hematoksilen ve eozin boyama, yaygın eritrosit ekstravazasyonu ile birlikte şiddetli miyokardiyal yıkım göstermiştir. SD-C57 Black 6 grubunda ise hematoksilen ve eozin boyama, ağırlıklı olarak inflamatuar infiltratlarla karakterize miyokardiyal hasar göstermiştir.

SD'den BALB/c'ye yapılan grupta, immunofloresan boyama minimal CD3 pozitif T hücresi infiltrasyonu, minimal CD68 pozitif makrofaj infiltrasyonu ve yoğun, yaygın C4D depozisyonu göstermiştir. SD'den C57 Black 6'ya yapılan grupta, immunofloresan boyama belirgin CD3 pozitif T hücresi infiltrasyonu, orta düzeyde CD68 pozitif makrofaj varlığı ve orta düzeyde C4D depozisyonu göstermiştir. Üç kişilik grupta ortalama başarı oranı %93,3 iken, tek kişilik grupta bu oran %86,7 olarak gerçekleşmiştir.

Ekip korelasyonundaki temel zorluk; uygulama pratiği, daireselleştirme ve kararlı ve biçimlendirilmiş modern bir kuruluşun sağlanmasıdır. Gelecekteki çalışmalar, ksenogreft immünomekanizmalarını araştırmak ve standart immünosüpresif veya tolerans indükleyici süreçleri değerlendirmek için bu standartlaştırılmış modeli kullanabilir.