Minibiyoreaktör Dizisinin (MBRA) montajı ve kullanımı için güncellenmiş protokol

Bu nedenle araştırmamız bağırsak mikrobiyomuna, özellikle de zararlı patojenlerin kolonizasyonunu önlemek için nasıl tasarlanabileceğine odaklanıyor. Aynı zamanda, bu kolonizasyon direncinin arkasındaki ekolojik kuralları ve mekanizmaları anlamakla da ilgileniyoruz. Yeni nesil dizileme, gelişmiş biyoinformatik, mikropsuz fareler ve in vitro bağırsak modelleri gibi teknolojilerin tümü, mikrobiyal toplulukları ve bunların sağlık ve hastalıktaki rollerini inceleme şeklimizi değiştiriyor.

İn vitro bağırsak modelleriyle ilgili en büyük zorluklardan biri, onları yüksek verimde çalıştırmaktır. İhtiyacımız olan şey, mikrobiyal toplulukların geniş ölçekte işlevsel olarak sorgulanmasına izin veren sistemlerdir. Minibiyoreaktör dizisi, diğer sistemlerdeki verim kapasitesi eksikliğini gidermek için tasarlanmış sürekli akışlı bir kültür sistemidir.

Karmaşık ve tekrarlanabilir mikrobiyal topluluk davranışlarını yakalamaya devam ederken deneyleri büyütmemize olanak tanır. Başlamak için minibiyoreaktör dizisi şeritlerinin 3D baskılı olduğundan ve altı bağımsız biyoreaktör odası içerdiğinden emin olun. Montaj için gerekli tüm bileşenleri düzenleyin.

T kollu musluk anahtarıyla 1/4 inç 28 NF fraksiyonlu musluğun kullanılması. Bağlantı parçalarını yerleştirmek için her bölmedeki üç adet 1/4 inçlik bağlantı noktasını geçirin. Hazneyi suyla yıkadıktan sonra, her hazneye 10 x 3 milimetrelik bir manyetik karıştırma çubuğu yerleştirin ve bir mililitre damıtılmış su ekleyin.

Daha sonra biyoreaktörün her bir portunun üzerine lastik bir rondela yerleştirin. Her hazne için, bir ortam saman dişli erkek yemi, bir atık saman dişli erkek yemi ve bir boş dişli erkek yemi bağlantı noktalarına vidalayın. Şimdi 3/32 inçlik dişi yem dikenlerine altı lastik septa yerleştirin ve boynu örtmek için her septumun üst manşonunu aşağı katlayın.

Bunları her odanın belirlenmiş bağlantı noktalarına takın. İstenilen uzunluk ve sayıda C-flex boru şeritlerini kesin. Her bir boru uzunluğunun bir ucuna 1/8 inçlik bir dişi yem dikeni ve diğer ucuna bir erkek yem kilidi konektörü takın.

Ardından, 1,14 milimetre iç çapa sahip kırmızı iki duraklı E-lab tüpünün ve 0,89 milimetre iç çapa sahip turuncu iki kademeli E-lab tüpünün her iki ucuna 1/16 inçlik bir dişi yem dikeni yerleştirin. Hazırlanan E-lab tüpünü C-flex tüpüne bağlayın ve altı C-flex tüp uzunluğunun her birinin dişi yemler aracılığıyla bir kırmızı ve bir turuncu E-lab hattına bağlandığından emin olun. Daha sonra C-flex boruyu gerektiği gibi farklı uzunluklarda kesin.

1/8 inç dişi yem dikenini ve bir erkek yem kilidi konektörünü 3 inçlik bir parçanın ve 12 inçlik C-flex boru parçasının her iki ucuna takın. Kalan parçaların her iki ucuna erkek yem kilidi konektörlerini takın. Atık hattı ağacını 3D diyagrama göre birleştirin.

Kırmızı iki duraklı E-lab borunun açıkta kalan uçlarını, C-flex boru uzunluğuna bağlı olarak artan sırada atık hattı ağacındaki terminal erkek yem kilitlerine takın. Ardından, 3 inçlik C-flex boruyu 1/8 inçlik dişi yem dikeni ve erkek yem kilidi konektörü ile atık hattı ağacının tepesine bağlayın. Besleme hattı ağacını 3D diyagrama göre monte edin.

Turuncu iki duraklı E-lab borunun açıkta kalan uçlarını, C-flex boru uzunluğuna göre artan sırada besleme hattı ağacındaki terminal erkek yem kilitlerine köprüleyin ve 12 inçlik C-flex boruyu besleme hattı ağacının tepesine takın. Besleme hattı ağacının sonundaki değişken uzunluktaki C-flex boruyu biyoreaktöre takın ve bunları soldaki en kısa çizgiden sağdaki en uzun çizgiye doğru artan sırada düzenleyin. Atık hattı ağacının sonundaki değişken uzunluktaki C-flex boruyu, pompa yerleşimine uyum sağlamak için en uzun hat solda ve en kısa hat sağda olacak şekilde azalan sırada biyoreaktör şeridine takın.

Tüm C-flex besleme hatlarını şeridin sol tarafında bir araya toplayın ve bunları bir büküm bağıyla sabitleyin. C-flex hatları arasında turuncu iki duraklı E-lab tüpü ile bir döngü oluşturun ve döngüyü otoklav bandı kullanarak sabitleyin ve biyoreaktör şeridinin atık tarafındaki kırmızı iki duraklı E-lab tüpü için işlemi tekrarlayın. Atıkların ucundaki dişi yemi örtün ve kirlenmeyi önlemek için hat ağaçlarını folyo ile besleyin.

Otoklavlama sırasında buharın kaçmasına izin vermek için her biyoreaktör odasındaki septalı erkek dişli yemleri gevşetin. Düzeneği bir otoklav silosuna yerleştirdikten sonra, besleme ve atık hattı ağaçlarını MBRA şeritlerini içerenin bitişiğindeki ayrı kutulara uzatın. Sistemi pompalara bağlamak için, hem atık hem de besleme hatları için E-lab borularını sabitleyen otoklav bandını çıkarın ve C-flex boru demetlerini çözün.

MBRA'yı karıştırma plakasının üstündeki iki pompa arasına yerleştirin. 3D baskılı tutucuları kullanarak sıkıştırın ve plaka üzerindeki işaretli karıştırma konumlarıyla hizalayın. Şimdi besleme hattı E-lab hortumunu peristaltik pompa kartuşlarına takın ve boru durdurucularını kartuş yuvalarına yerleştirin.

Karıştırma plakasının sağında bulunan pompadaki atık hattı E-lab hortumu için işlemi tekrarlayın. Ardından peristaltik pompa kartuşlarını pompaya kilitleyin. 3D baskılı tüp tutucuları kullanarak C-flex boruyu düzgün bir şekilde düzenleyin.

Atık hattı ağacının ucunu atık şişelerine bağlı boruya bağlayın. Ardından, besleme hattı giriş borusundaki dişi yemi, ortam şişesi kapağından 12 inçlik boru üzerindeki erkek konektöre takın. Medya akışını başlatmak için her iki pompayı da açın ve atık pompaların sağına yerleştirildiğinde her iki pompanın da saat yönünde dönüşe ayarlandığından emin olun.

Her biyoreaktör odasındaki damlacık boyutunu ve kadansını gözlemleyin. Herhangi bir değişkenlik veya anormallik fark edilirse, akış hızı değişimini azaltmak için etkilenen odaya bağlı turuncu iki duraklı E-lab hortumunu değiştirin. Odalar dolduğunda, her iki pompayı da kapatın ve deneye başlamadan önce kontaminasyon olup olmadığını kontrol etmek için biyoreaktörlerin 24 ila 48 saat beklemesine izin verin.

Medya girişini deiyonize suda bir litrelik %10 ağartıcı kabına geçirin ve biyoreaktör odalarının içeriğini ağartıcı ile değiştirmek için her iki pompadaki akış hızını maksimuma çıkarın. Hazneler ortamdan arındırıldıktan sonra, beş dakika boyunca dolum çizgisinin üzerinde dezenfekte etmek için MBRA'yı ters çevirin. Beş dakika sonra sistemi düzeltin ve sterilizasyon için beş dakika daha bekleyin.

Hazneler ortamdan arındırıldıktan ve 10 dakika sterilize edildikten sonra, ağartıcıyı bir litre deiyonize su ile değiştirin ve su geçene kadar sistemi yıkayın. Ardından biyoreaktör E-lab borularını pompalardan ayırın ve MBRA'ları çıkarın. Kullanılmış septaları biyoreaktörden çıkarın ve yalnızca bir mililitre su kalana kadar her odayı boşaltın.

Septayı, turuncu iki duraklı E-lab tüpünü değiştirin ve daha önce gösterildiği gibi tamamen monte edilmiş şeridi otoklavlayın. Üç döngü yeniden kullanımdan sonra aşağıdaki adımları izleyin. Bir insan dışkı örneği hazırlandı ve MBRA sisteminde büyütüldü.

Dört günlük sürekli akıştan sonra, dokuz biyoreaktörün tamamındaki mikrobiyal topluluğa, her biri herhangi bir kopyada nispi bolluğun en az %2'sini içeren 18 bakteri cinsi hakim oldu. Tespit edilen 65 cinsten 22'si, dokuz biyoreaktör kopyasının hepsinde mevcuttu ve bu da yüksek tekrarlanabilirlik gösteriyordu. Alfa çeşitlilik analizi, hem gözlemlenen operasyonel taksonomik birimlerde hem de Shannon Çeşitlilik İndeksi'nde kopyalar arasında minimum varyasyon gösterdi.