İskelesiz Fare Yumurtalık Folikül Kültürü için Özelleştirilebilir Agaroz Kalıplarının Üretimi ve Kullanımı

Araştırmamız, in vitro yetiştirilen foliküllerin ve geliştirdikleri oositlerin kalitesini iyileştirip iyileştiremeyeceğini belirlemek için özelleştirilebilir, fizyometik ve iskelesiz bir folikül kültürü yöntemi geliştirmeyi amaçlamaktadır. Şu anda en gelişmiş kültür yöntemi, foliküllerin folikülogenez sırasında üç boyutlu mimarisini korumasına olanak tanıyan hidrojel kapsüllü, in vitro folikül büyüme sistemi kullanır. Hidrojen kapsülleme teknik olarak zorlu, zahmetli, düşük verimlilikte ve ne yazık ki otomatik görüntüleme yöntemleriyle uyumlu değildir.

Ayrıca, 3D kapsülleme uniform destek sağlar ve bu da in vivo fizyolojiyi taklit etmez. Oositlerin son derece hassas hücrelerini destekleyen 3D baskılı, biyouyumlu kalıplar oluşturduk. İskelesiz ortamda yetiştirilen foliküller, yerleşik tekniklere kıyasla hormon üretimini tehlikeye atmadan daha iyi büyüme ve yumurtlama göstermiştir.

Foliküllerin doğal ortamını daha iyi taklit edebilecek, kullanıcı dostu ve özelleştirilebilir bir kültür sistemi ihtiyacını ele alıyoruz. Zaman geçişli görüntüleme ayrıca folikül performansının canlı takibi ve analizini sağlar. Başlamak için, CAD yazılımını bir bilgisayar sisteminde başlatın.

Yazılımda 24 kuyuklu master kalıp baz tasarım adım dosyasını açın. Nesnenin iç yüzey alanını seçin. Sonra tasarım çalışma alanında Solid sekmesine gidin ve istediğiniz mikrokalıp tasarımını eklemek için Create Sketch'i seçin.

Şimdi, istenen x ve y boyutlarını ve mikrokuyunun sayısını tanıtın. Sonra araç çubuğunda Finish Sketch'i seçin. Ekstrüze fonksiyonunu kullanarak 800 mikrometre derinliğindeki mikrokuyları sırayla Solid, Create ve Extrude seçerek oluşturun.

Şimdi, mikro kuyrukların üstünde Design, Solid, Modify ve Fillet seçeneklerine tıklayarak 0,1 milimetre yarıçaplı bir fileto seçin. 0,25 milimetrelik yarıçaplı bir fileto ekleyerek yuvarlak tabanlı bir mikro kuyu oluşturun. Yeni ana kalıp tasarımını kaydedin ve Dosya'yı seçip Dışa Aktar'a basarak bir kopyayı adım formatında dışa aktarın.

24 kuyuyla silikon döküm konteyneri bir adım dosyasını açın. Sonra, kaydedilen dosyaya sağ tıklayıp Mevcut Tasarıma Ekle seçeneğini seçerek yeni ana kalıp tasarımını harici bileşen olarak ekleyin. Sonra, eklenen bileşene sağ tıklayın ve ana kalıp tasarımına referansı kaldırmak için Break Link seçeneğini seçin.

Yeni ana kalıp tasarımı, 24 kuyululuklu silikonlu döküm konteynerin bir yüzeyi içinde merkezlenerek içe bakmasını sağlar. Nesneleri hizalamak için OK'yi seç. Kesim işlemini seçin; kabı hedef gövde olarak, ana kalıpı ise alet gövdesi olarak kullanarak silikon kalıplama boşluğunu oluşturun.

Yeni 24-kuyu silikon kalıp olanı stl ve step dosyaları olarak kaydedip dışa aktarın. Yeni 24 kuyu silikon kalıp bir ve 24 kuyuk silikon döküm konteyner iki stl dosyalarını 3D baskı hazırlama yazılımı ile açın. Baskıyı mikro sütunlar yukarıya bakacak şekilde yönlendirin ve Drill Hole fonksiyonunu kullanarak baskının yanına bir milimetre genişliğinde bir açıklık oluşturun.

Her iki konteyner tasarımını da 25 mikrometre katman kalınlığında bastırın. Bitmiş baskıları üreticinin talimatlarına göre yıkayın. Sonra mikro sütun bölümüne %95 izopropanol ile yoğun şekilde püskürtün.

Kalan etanolü sıkıştırılmış havayla çıkarın. Kurutulup kürledikten sonra her baskıyı stereo mikroskopla inceleyin. Tüm mikro sütunların ayrı ve boyut ile görünüm açısından eşit olduğundan dikkatlice emin olun.

Sertleştikten sonra, matkap kanalı doldurulmadıysa baskının dışını Parafilm ile kaplayın ve daha fazla kullanılana kadar saklayın. Sonra, hazırlanan silikonu hava kabarcıklarını çıkarmak için beş dakika boyunca vakum kurutucuya koyun. Silikon karışımını 3D baskılı kalıba eşit bir akışla dökerek düzlüğün kalıbın yüzeyine uygun veya biraz altında olduğundan emin olun.

Hapsolan havayı P200 pipet ucu ile çıkarın ve gerekirse tekrar gaz çıkarın. Silicon'u oda sıcaklığında en az beş saat veya tercihen gece boyunca kurutucuda kurutabilirsiniz. Sertleştikten sonra silisonu kalıptan çıkarın ve mikrokalıpları stereo mikroskop altında inceleyin.

Matkap kanalındaki fazla malzemeyi çıkarın ve köprülü veya hasarlı kuyulu kalıpları atın. Sonra, silikon kalıbı ikinci kalıplama aşaması için silikon kalıp kabı iki konteynerine yerleştirin ve yan açıklığın hizalı olduğundan emin olun. Silikon küfe hafifçe embriyo güvenli mineral yağ sıçtırın.

Mikro kuyulardan fazla yağları sıkıştırılmış hava kullanarak çıkarın. Silikon karıştırma prosedürünü tekrarlayın ve yeni karışımı ikinci kaba döker, seviyeyi kalıp yüzeyinde veya altında tutarak. Ertesi gün, silisonu 3D baskılı kalıptan ayırın ve silikon kalıpları birbirinden birer ve iki kalıbı oluşturur.

Mikroskobik olarak inceledikten sonra, kuyularda mikro sütunları veya fazla yağ olan kalıpları atın. Şimdi, silikon kalıpı %70 etanol ile yıkayın. 30 dakika boyunca laminar akış başlıkta hava kurumasına izin verin.

Kuruduktan sonra, kalıpı otoklavlamadan önce sterilizasyon torbasına koyun. Folikül transferi sırasında hassasiyeti artırmak için soyucu ucu hafifçe bük. pH veya sıcaklık dalgalanmalarını önlemek için folikülleri hızlıca transfer edin.

Mikroskop altında, 200 mikrometrelik bir soyucu ucu kullanarak mikromolda 10 çok katmanlı ikincil folikül aktarın ve bitişik mikro kuyulara yerleştirilir. Kurulumu tamamlamadan önce tüm 10 folikülün aynı boyutta olduğundan emin olun. Sonra, bir el mikroskobuna bir ışık odaklayıcı kapağı yerleştirin.

Mikroskobu montajlı bir kuluçka makinesine yerleştirin ve yazılımla birlikte bir dizüstü bilgisayara bağlayın. Kültürü mikroskop altında iyi konumlandırın ve hizala, yüksekliği ve odaklama ayarlayarak tüm foliküllerin görünür olmasını sağlayın. Otomatik beyaz dengesi, AWB ve LED kontrolü kullanın.

Otomatik pozlamayı, AE'yi kapatın ve optimal pozlama süresini seçin. Sekiz gün süren ve 30 dakikalık aralıkla zaman geçişli görüntülemeye başlayın. Fotoğrafı seçin ve görüntü çekmediğinizde LED'i kapatın.

Agararoz mikroküflerinde kültürlenen foliküller sürekli büyüme ve antral boşluk oluşumu göstermiştir. Ovulasyon indüklenmesinden sonra, agaroz mikroküflerinde kültürlenen foliküller, alginattakilere göre daha fazla yumurtlanmış yumurta verdi. Biyouyumluluk bir daha olarak M2 yumurtalarının iğne morfolojisinin gruplar arasında anlamlı bir şekilde farklı olmamasıdır.

Aljinat kapsüllü foliküller kültür sırasında pozisyonlarını korumamıştır ve zaman geçişli görüntüleme ile uyumsuzdur. Zaman geçişli görüntüleme sırasında, Feret çapı, daireselliği ve en-boy oranı dahil olmak üzere bireysel folikül morfolojisi, kültür dönemi boyunca anında takip edilip ölçülebilirdi. Optik koherens tomografisi, iç folikül yapılarının 3B görselleştirilmesini mümkün kıldı ve yumurtlama sırasında dinamik folikül yırtma olaylarını da yakaladı.

Agararoz mikrokalıpları, parafin gömülmesi ve kesimlenmesinden sonra aynı düzlemde birden fazla folikülün histolojik analizini mümkün kılmıştır; bu da doku varlığını veya yokluğunu tespit etmeyi ve H&E boyamasını desteklemiştir. Bu yöntemin özelleştirilebilirliğini göstermek için, her kalıp başına 10 mikro kuyu içeren yüksek verimli, 96 kuyu bir versiyon oluşturuldu ve başarılı bir şekilde üretildi. 24 kuyu tasarımında olduğu gibi, foliküllerin zaman geçişli görüntülemesiyle uyumluydu.