SASP Faktörlerinin Kanser Hücrelerinin Proliferasyonu Üzerindeki Etkisinin Üç Farklı Metodolojinin Karşılaştırmalı Analizi Kullanılarak Değerlendirilmesi

Yaşlanan kanser hücreleri, komşu hücreleri etkileyen faktörleri salgılar. SASP kaynaklı parakrin ve yüksümlü etkileri HeLa hücre çoğaltmasında incelemek için üç in vitro model sunuyoruz; gerçek zamanlı empedans izleme ve canlı hücre görüntüleme destekli dinamik, kinetik ve morfolojik analizler geleneksel son nokta testlerinin ötesinde yaşlanmış ve mikroçevresel parakrin etkileri ortaya koymaktadır. Başlamak için, hücre tohumlamadan önce gerçek zamanlı hücre analiz sistemini aç.

RTCA yazılım sürüm 2.0'ı yayına çıkarın. X notları butonuna tıklayın ve deneysel detayları girin. Plan butonuna tıklayın ve arka plan kaydetmek için iki adım ekleyin; hücre çoğalmasını her 15 dakikada bir 72 saat boyunca izleyin.

İlk adımı seçin ve Oynat'a tıklayın. E-plaka görünümünün her kuyusuna manuel olarak 50 mikrolitre tam ortam ekleyin. Sonra, hem yaşlanan hem de yaşlanmayan HeLa hücrelerini beş mililitre steril, önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın.

Aspirasyondan sonra, bir mililitre önceden ısıtılmış %0,05 tripsin ekleyin ve kuluçka yapın. Tripsini, beş mililitre antibiyotikle takviyeli tam DMEM ile nötralize edin. Sonra, hücreleri oda sıcaklığında 500 G'de 10 dakika boyunca santrifüjle yapın.

Süpernatant atıldıktan sonra, hücre pelletlerini beş mililitre antibiyotikle takviyeli tam DMEM içinde yeniden askıya alın. Şimdi, 100 mikrolitre antibiyotikle takviyeli tam DMEM içinde bir e-plaka görünümünün her bir kuyusuna yaşlanmayan HeLa hücreleri ekin. E-plaka görünümünü gerçek zamanlı hücre analiz sisteminin beşiğine yerleştirerek hücrelerin inkubatördeki plaka yüzeyine bağlanmasını sağlar.

İkinci adımı seçin ve empedans ölçümüne başlamak için Play tuşuna tıklayın. E-plakadaki tohum hücreleri, üç farklı deneysel düzen altında 60 mikrolitre antibiyotikle takviyeli tam DMEM içeren kuyular yerleştirir. E-plaka insertini %5 karbondioksit ile inkübatörde 37 derece Celsius sıcaklığında altı saat boyunca tutun.

Altı saatlik hücre tohumlamasından sonra Duraklatma tuşuna tıklayın, ardından e-plaka görünümündeki her bir delikten kültür ortamını nazikçe aspire ederek serum ve yapışmayan hücreleri çıkarın. Kuyular 37 derece Celsius'ta önceden ısıtılmış PBS ile iki kez yıkayın. E-plaka görünümünün her bir kuyusuna 140 mikrolitre serumsuz DMEM ekleyin.

Ortamı çıkarın. E-plaka insertinin kuyuklarını PBS ile yıkayıp ardından 60 mikrolitre serumsuz DMEM ekleyin. Şimdi, e-plaka girişini e-plaka görünümüne yerleştirin.

Inserti kuyuya tamamen yerleştirilene kadar nazikçe bastırın. Birleşik plakayı gerçek zamanlı hücre analiz sistemine yerleştirin. Yazılım kullanılarak hücre indeks değerlerinin 15 dakikalık aralıklarla gerçek zamanlı izlenmesine devam etmek için Play tuşuna tıklayın.

E-plaka görünümü ve e-plaka girişinin birleştirilip gerçek zamanlı hücre analiz sistemine yerleştirildiği zaman noktasında hücre indeks değerlerini normalleştirin. Sonra, gerçek zamanlı hücre analiz sisteminden elde edilen maksimum hücre indeksi ve eğim verileriyle proliferasyon oranı ve miktarını hesaplamak için Veri Analizi düğmesine basın. Sonra, verileri uygun bir istatistiksel programla analiz edin.

Kültür ortamını, yaşlanan ve yaşlanmayan HeLa hücrelerini içeren altı kuyu plakalarından aspirasyon yapın. Hücreleri 37 derece Celsius'ta önceden ısıtılmış PBS ile iki kez yıkayarak kalan serum ve hücre kalıntılarını çıkarın. Her kuyuya iki mililitre serumsuz antibiyotikli DMEM ortamı ekleyin, ardından hücreleri nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde, %5 karbondioksit ile 37 derece Celsius'ta 48 saat boyunca kuluçka içinde.

Her kuyunun koşullandırılmış ortamını laminar güvenlik kabininde steril tüplere toplayın. Toplanan koşullu ortamı 1000 g sıcaklıkta, dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüjlenerek hücre kalıntılarını çıkarıyor, ardından 10.000 g ile 10 dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yaparak şeffaf süpernatan elde ediliyor. Sonra, iki mililitrelik ultra-santrifüj filtre üniteleriyle dört derece Celsius'ta 3000 g ve 60 dakika boyunca konsantre edilerek 400 mikrolitre konsantre edilir.

Elde edilen konsantre, steril tüplerde laminar güvenlik kabininde 1x, 2x ve 3x konsantre koşullu ortam hazırlamak için taze, serumsuz ortamla seyreltirin. Hücreler tutunduğunda, e-plaka görünümündeki her bir delikten kültür ortamını nazikçe aspire ederek serum ve yapışmayan hücreleri çıkarıp PBS ile yıkayın. Sonra, her gruba 37 derece Celsius sıcaklığında toplanan koşullu medyayı önceden ısıtmış 200 mikrolitre pipetle.

E-plaka görünümünü gerçek zamanlı hücre analiz sistemine takın ve 48 saat boyunca hücre indeks değerlerinin gerçek zamanlı izlenmesine 15 dakika aralıklarla devam etmek için Oynat'a tıklayın. Tohum hücreleri üç deneysel kurulum altında mikro slayta yerleştirilir ve %5 karbondioksit ile nemlendirilmiş atmosferde 37 derece Celsius sıcaklıkta kuluçka yapılır. Sekiz saatlik yapışmadan sonra, hücreleri 37 derece Celsius'ta önceden ısıtılmış PBS ile iki kez yıkayın.

Her kuyuya serumsuz Dulbecco's Modified Eagle's Medium 200 mikrolitre ekleyin. Temp-controller 2002-2'yi aç ve 37 derece Celsius ayarla. CO2-Controller 2000'i açın ve %5 karbondioksit seviyesine ayarlayın.

Floresans ışık kaynağını açın. Slaytı sahne üstü kuluçka odasına yerleştirin. Bilgisayarda yazılımı başlatın.

20x hedefi seçin. Faz kontrast kanalı ve floresans FITC kanalını ekleyin. Sahne kontrolcüsü ile her konumun konumlarını işaretleyin.

Zaman aralığını 30 dakikaya, satın alma süresini 48 saat olarak ayarlayın, ardından satın alma işlemini başlatın. Her iki zaman noktasında da yeşil floresan protein pozitif hücreleri sayın ve analiz için yüzde artışını hesaplayın. Doksorubisin tedavisi, HeLa hücrelerinde hücresel yaşlanmayı önemli ölçüde tetiklemiştir.

SA-beta-gal-pozitif hücrelerin nicel ölçümü, doksorubisinle tedavi edilen grupta kontrol grubuna göre anlamlı şekilde daha yüksek bir oran gösterdi. İlk yaklaşımda, yaşlanmayan HeLa hücreleriyle birlikte kültürlenen yaşlanmayan HeLa hücreleri, yaşlanmayan HeLa hücreleriyle birlikte kültürlenen hücrelere kıyasla belirgin şekilde artan proliferasyon oranı ve kapasitesi göstermiştir. Yaşlanan HeLa hücrelerinden 2x ve 3x konsantrasyonlarda elde edilen koşullu ortamlar, yaşlanmayan HeLa hücrelerinin çoğalma hızını ve kapasitesini, yaşlanmayan hücrelerden elde edilen koşullu ortamlara kıyasla önemli ölçüde artırmıştır.

Üçüncü yaklaşımda, 48 saatlik ortak kültür sonrası, GFP pozitif HeLa hücreleri, yaşlanmış HeLa hücreleriyle birlikte kültürlendiğinde, yaşlanmayan veya sadece GFP içeren kontrollere kıyasla proliferasyonda anlamlı bir artış göstermiştir.