Aksonal Yaralanma Modelleri Yapımı ve Çoklu Omik Analizin Etkinleştirilmesi için Mikroakışkan Çip

Aksonal hasarı takiben nöronların metabolik mekanizmasını göstermek amacıyla multiomik analizi mümkün kılmak için büyük ölçekli mikroakışkan çipler geliştirdik. Aksonal yaralanma ve rejenerasyon sırasında nöronların metabolik mekanizmaları üzerine araştırmaları ilerletmek için esas olarak mikroakışkan teknolojisi, metabolik akış analizi ve transkriptomikleri kullanıyoruz. Farklı gelişimsel hastalıklarda kortikal nöronlar arasında metabolik farklılıklar olduğunu ve genç nöronların dış yaralanmadan sonra metabolik yeniden şekillenmeye uğradığını bulduk.

Protokolümüzün temel avantajı, doğru multiomik ve milyonlarca hücre boyutuna olanak tanıyan daha büyük ölçekli mikroakışkan platform tasarımı ve operasyonel standartlarda yatmaktadır. Başlamak için, PDMS bazını ve kürleme maddesini bir santrifüj tüpüne aktarın. Karışımı içeren santrifüj tüpünü santrifüjlü karıştırıcı karıştırıcıya yerleştirin.

Karıştırmak ve gazdan arındırmak için 2.000 G'de dört dakika boyunca iki kez santrifüjleyin. Gazdan arındırılmış PDMS'nin 13 ila 15 gramını mikroakışkan kalıba dökün ve kalıbın tabanının tamamen kaplandığından emin olun. Şimdi kalıbı bir vakumlu kurutucuya yerleştirin, ardından PDMS'deki kabarcıkları tamamen çıkarmak için havayı beş ila 10 dakika boşaltmak üzere bir vakum pompası kullanın.

Kauçuk bir ampul kullanarak, kalan yüzey kabarcıklarını kırmak için PDMS'nin yüzeyine hafifçe vurun. Kalıbı bir konveksiyon fırınına aktarın ve polidimetilsiloksanı sertleştirmek için 80 santigrat derecede 100 dakika pişirin. PDMS tamamen sertleştikten sonra, dikkatlice kaldırmak ve kalıptan ayırmak için bir neşterin ucunu PDMS'nin kenarının altına hafifçe kaydırın.

2.0 ila 2.5 milimetre çapında bir biyopsi zımbası kullanarak, kültür ortamı infüzyonu ve hücre yüklemesi için PDMS'de delikler oluşturun. Yapışkan bant kullanarak PDMS'deki yüzey kirlerini temizleyin, ardından temiz bir cam kaba koyun ve saklamak için alüminyum folyo ile sarın. Deneyden önce, steriliteyi sağlamak için mikroakışkan cihazı 121 santigrat derece ve 101 kilopaskal'da beş dakika otoklavlayın.

35 milimetrelik bir kültür kabına geleneksel mikroakışkan cihazlar için tasarlanmış bir lamel yerleştirin. Yemeğe mililitre poli-D-lizin çözeltisi başına iki mililitre 0.1 miligram ekleyin. Çanağı 37 santigrat derecede altı saat veya gece boyunca inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, yeniden kullanım veya uygun şekilde imha etmek için poli-D-lizin çözeltisini dikkatlice alın. Şimdi tabağa iki mililitre steril ultra saf su ekleyin. Saat yönünde 50 kez, ardından saat yönünün tersine 50 kez döndürün.

Steril bir pipet ucuna bağlı bir vakum pompası kullanarak suyu aspire edin ve atıkları sıvı atık kabında toplayın. Tüm yıkamalar tamamlandıktan sonra, kullanmadan önce lamellerin bir biyogüvenlik kabininde doğal olarak kurumasını bekleyin. Steril ince uçlu forseps kullanarak, otoklavlanmış mikroakışkan çipi, mikro kanallar aşağı bakacak şekilde cam yüzeyin ortasına yerleştirin.

Tam yapışmayı sağlamak için çipi 200 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak cam yüzeye hafifçe bastırın. Ardından, soma bölmesini belirtmek için kalıcı bir işaretleyici kullanarak sol bölmeyi bir nokta ile işaretleyin. 10 mikrolitrelik bir pipetle 10 mikrolitre nöronal süspansiyonu aspire edin, ardından süspansiyonu işaretli soma bölmesinin üzerindeki yükleme portuna yavaşça dağıtın.

Sol bölmenin alt rezervuarına uygun sıvı akışını onaylayın. Kültür kabını 20 dakika boyunca 37 santigrat dereceye ve% 5 karbondioksite ayarlanmış nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın. İnkübasyondan sonra, mikrokanallar yoluyla soma bölmesinden aksonal bölmeye ortam bolluğunu doğrulamak için kabı 20X mikroskop altına yerleştirin.

Şimdi, aksonal bölmenin üst portuna 150 mikrolitre nöronal bazal ortam pipetleyin. Benzer şekilde, soma bölmesinin üst portuna 150 mikrolitre tam nöronal ortam ekleyin. Ardından, bir nem odası oluşturmak için 150 milimetrelik bir kültür kabına 20 mililitre ultra saf su dökün.

35 milimetrelik kültür kabını büyük kabın içine yerleştirin, ardından tüm kültür sistemini inkübatöre aktarın ve gerekli süre boyunca muhafaza edin. Büyük ölçekli mikroakışkan cihazı yerleştirmek için 10 santimetre genişliğinde bir Petri kabı kullanın. Her yöntem farklı aksonal yaralanma protokolleri gerektirdiğinden, deneysel ihtiyaçlara göre tam kanal veya aralıklı kanal tohumlamasını seçin.

Tohumlama tamamlandıktan sonra, nöron büyümesini sürdürmek için Petri kabına beş mililitre tam nöron kültürü ortamı ekleyin. Daha sonra kullanmak üzere uygun miktarda nöronal bazal ortamı 15 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Kortikal nöronlar içeren mikroakışkan bir cihazı temiz bir tezgaha yerleştirin.

Tüy bırakmayan kağıt kullanarak 35 milimetrelik kültür kabının altını kurutun, ardından ortamı mikroakışkan cihazın sağ tarafındaki iki delikten aspire etmek için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Daha sonra, bir vakum pompası hortumunu steril, filtresiz 200 mikrolitrelik pipet ucuna bağlayın. Vakum pompasını dakikada 60 litre emiş hızında açın ve eski ortamı aspire etmek için ucu akson terminal odasının alt deliği ile oda arasındaki bağlantı noktasına doğrultun, bu da negatif basınç nedeniyle akson kırılmasına neden olur.

Pipet ucunu yerine takın ve 150 mikrolitre nöronal bazal ortam çekin, sağ bölmenin alt deliğinden yavaşça ekleyin. Dört kez ekleme ve aspirasyon yapıldıktan sonra, taze tam nöronal ortam ile değiştirin, ardından eski ortamı hücre gövdesi yan deliğinden aspire edin ve gerekirse ilaç içeren taze tam nöronal ortam ekleyin. Mikroakışkan cihazı kültür kabı ile birlikte 150 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirin ve 24 saat gibi gerekli süre boyunca kültürlemeye devam edin.

Manuel aksonal yaralanma için, nöronları büyük ölçekli mikroakışkan cihazın tüm odalarına tohumlayın. Cihazı 37 santigrat derecede, %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde üç gün boyunca inkübe edin. Yedinci günde in vitro, mikroakışkan cihazı içeren kültür kabını inkübatörden çıkarın ve steril bir sahneye yerleştirin.

20X büyütmeli bir mikroskop hazırlayın ve çalışma alanını %75etanol kullanarak sterilize edin. 10 mikrolitrelik steril filtreli bir pipet ucunu tutun ve mikroskop rehberliğinde orijinal mikrokanallardaki akson demetlerini tanımlayın. Pipet ucunu kullanarak her akson demeti boyunca uzunlamasına çizikler yapın.

Akson kırılmasını mikroskop altında gerçek zamanlı olarak gözlemleyin. Standart bir mikroakışkan cihazın mikrokanalları, in vitro yedi günde beta üç tübülin boyaması ile doğrulandığı gibi, aksonların büyümesine izin verir, ancak soma ile değil. Nöronal yoğunluk, aksonal hasarı takiben anlamlı bir fark göstermedi, bu da gözlemlenebilir bir nöronal ölüm olmadığını gösterdi.

Multiomik analizler için üç boyutlu genişletilebilir tasarıma sahip büyük ölçekli bir mikroakışkan cihaz geliştirilmiştir. Hem deliksiz hem de delikli PDMS kopyaları, 10 santimetrelik çanaklara veya PC kartlarına güvenli bir şekilde yapıştırıldı. Pipet ucunun çizilmesinin neden olduğu aksonal hasar, yaralanmadan önceki sağlam aksonların aksine, morfolojisi bozulmuş açıkça kopmuş aksonlara yol açtı.

Aksonal rejenerasyon, yaralanmadan sonraki hem altı saat hem de 24 saatte gözlenirken, yaralanmamış aksonlar stabil kaldı. Nöronal protein konsantrasyonu, başlangıçta mililitre başına 1420.4 mikrogramdan, altı saatte mililitre başına 1748.9'a ve yaralanmadan 24 saat sonra mililitre başına 1823.7 mikrograma önemli ölçüde yükseldi. Kontrol ve akson yaralı gruplardan elde edilen RNA verimleri neredeyse aynıydı.

RNA dizilimi, gruplar arasında paylaşılan 17.471 gen ile 595 yaralanmaya özgü gen ve 609 kontrole özgü gen ortaya çıkardı. KEGG yolu analizi, yaralanma sonrası oksidatif fosforilasyon, reaktif oksijen türleri tepkisi, otofaji ve TCA döngü yollarının önemli ölçüde yukarı regülasyonunu tanımladı.