Crohn Hastalığı Benzeri İleit ve Fibrozisin SHIP Eksikliği Olan Fare Modelinde Terapötik Müdahalelerin Değerlendirilmesi

SHIP eksikliği olan fareleri, Crohn hastalığında bağırsak iltihabı ve fibrozisi tetikleyen mekanizmaları incelemek ve Crohn hastalığını tedavi etmek için yeni ilaçlar veya tedavi stratejilerini değerlendirmek için kullanıyoruz. Bu modeli, hedefli ilaç teslimatı için glikojen IBD ilaçlarının etkinliğini göstermek için preklinik çalışmalarda kullandık. Protokolümüz, doğal olarak ileal iltihap ve fibroz geliştiren SHIP eksikliği olan fareleri kullanır; bu da geleneksel kimyasal kaynaklı veya yaralanma temelli modellere göre fizyolojik olarak daha ilgili bir model sunar.

Bulgularımız, SHIP-eksitsiz fareleri ileal iltihab ve fibrozis için sağlam bir model olarak ortaya koymakta, Crohn hastalığı için mekanik çalışmalar ve tedavilerin klinik öncesi testlerini mümkün kılmaktadır. Başlamak için, testi yapmadan önce fareleri dört saat boyunca oruç tutun. Dört kilodalton FITC-dextran'ı steril PBS'de çözerek mililitrede 80 miligram nihai konsantrasyona ulaşın.

Sonrasında, her fareyi nazikçe sabitleyin ve ağızdan kullanılan garajla 150 mikrolitre FITC-dextran çözeltisi verin, ardından fareleri gavajdan sonra dört saat daha yemsiz tutun. Fare ötenazi yaptıktan sonra, kan toplamak için 25 gauge iğne ve bir mililitrelik bir şırınga ile kalp ponksiyonu yapın. Hemen toplanan her 100 mikrolitre kana antikoagülant olarak 10 mikrolitre asit-sitrat-dekstroz çözeltisi ekleyin.

Tüpü birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın. Toplanan kan örneklerini 1.500 G'de 10 dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüjlendirin. Plazmayı dikkatlice etiketlenmiş 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın.

Tüm örnekleri analiz için hazır olana kadar buz üzerinde ve ışıktan korunmuş tutun. Şimdi, her plazma örneğini PBS ile bire iki ve bire 10 oranlarında seyreltin. Her plazma seyreltmesinden 100 mikrolitre opak 96 kuyu bir plakaya ekleyip çift kuyulara yerleştirin.

Orijinal 80 miligram/mililitre FITC-dextran stokunun bir veya iki seri seyreltmesini PBS kullanarak farklı çözelti konsantrasyonları hazırlamak için gerçekleştirin. Her seyreltmeden 100 mikrolitre 96 kuyu plakasının çift kuyularına ekleyin. Daha sonra, uyarılma için 485 nanometre ve emisyon için 535 nanometreye ayarlanmış mikroplaka okuyucu kullanarak floresansı ölçün.

Kan alımı sonrası FITC-dextran testi için farenin tüm ince bağırsağı dikkatlice çıkarılın. Bağırsaktaki yapışkan yağ ve bağ dokusunu nazikçe çıkarın. Temizlenmiş bağırsağı görsel kontrastı artırmak için boş beyaz bir kağıt üzerine düz bir şekilde yerleştirin.

Dokuyu herhangi bir makroskobik hastalık belirtisi için görsel olarak inceleyin, özellikle iltihapın sıkça görüldüğü SHIP knockout farelerinde distal 10 santimetre dikkat edin. Bağırsağı bir cetvel yanına hizalayarak ölçek sağlanır ve tüm örneği fotoğraflayarak herhangi bir büyük patolojik bulguları belgeleyin. Bağırsak içeriğini çıkarmak için aşırı kuvvetten kaçınarak bağırsak lümenini PBS ile nazikçe yuyun ve böylece vilüs ve kript mimarisinin bozulmasını önleyin.

Distal ileumun en büyük patolojiyi temsil eden bölgesini belirleyin ve yaklaşık bir santimetre doku kesin. Kesilen dokuyu histoloji kasetine düz yerleştirin ve fiksasyon sırasında katlanmayı önlemek için iki sünger arasına sıkıştırın. Hematoksilin ve eozin boyama ile Masson'un trikrom boyaması için, dokuyu %10 nötr tamponlu formalin ile 10 ila 20 katı doku hacmi kullanılarak gece boyunca dört derece Celsius'ta sabitleyin.

Sabitlemeden sonra, kasetleri depolama için %70 etanole aktarın ve işleme kadar tamamen su altında kaldıklarından emin olun. Alcian mavisi ve periyodik asit-Schiff boyama için, dokuyu Carnoy çözeltisinde gece boyunca dört derece Celsius'ta sabitleyin. Fiksasyondan sonra, kasetleri işlem öncesi depolama için %100 etanole aktarın.

Sonra, sabit dokuları parafine gömüp beş mikrometrelik dilimlere ayırarak daha sonra boyama yapılmasını sağlar. Hematoksilin ve eozin boyalı ileal kesitleri, tanımlanmış histopatolojik kriterlere göre 16 puanlık bir ölçekle puanlayın. Masson'ın trikrom boyalı kesitlerini, önceden belirlenmiş kriterlere dayalı altı noktalı bir ölçekle değerlendirin.

Deneysel koşullara kör olan iki bağımsız hakem tarafından verilen puanların ortalaması olarak nihai fibrozis puanını hesaplayın. Histoloji örneğinin diseksiyon ve çıkarılmasının ardından, ileumun distal 10 santimetresinin kalan kısmı toplanır. Toplanan dokuyu kağıt havlu veya tüy içermeyen bir mendil ile kurutun, ardından mendil ağırlığını kalibre edilmiş bir tartı ile kaydedin.

Dokuyu sıvı azotta ani dondurmadan sonra daha sonra en 80 derece Celsius sıcaklıkta saklanarak gelecekte işleme alın. İşleme hazır olduğunda, donmuş dokuyu alın ve her zaman buzda kalın. Sonra, doğru kütle için doku örneklerini tekrar tartın.

Homojenleştirme tamponunu PBS'ye proteaz inhibitörü ekleyerek hazırlayın. Her miligram doku için 10 mikrolitre tampon kullanın. Bir tezgah üstü homojenizatör kullanarak, buz soğukluğu homojenizasyon tamponunda tam kalınlıktaki ileal dokuyu homojenleştirin.

Homojenat uniform ve görünür doku parçalarından arınana kadar devam edin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için örnekler arasında homojenizator ucunu PBS ile iyice durulayın. Santrifüjle dokunun 10.000 G'de 10 dakika boyunca dört derece Celsius sıcaklığında homojenleşmesi sağlanır.

Aliquot, selenmiş süpernatanları donma-erime döngülerini önlemek için daha küçük hacimlere ayırın, ardından gelecekteki analiz için eksi 80 derece Celsius'ta saklayın. Histolojik analizler, SHIP eksikliği olan farelerde SHIP kontrollerine kıyasla anlamlı şekilde daha fazla bağırsak hasarı göstermiştir. Deksametazon tedavisi, SHIP eksikliği olan farelerde histolojik hasarı azalttı, ancak bu azalma istatistiksel olarak anlamlı değildi.

Masson'ın trikrom boyaması, SHIP eksikliği olan farelerde SHIP kontrollerine göre kolajen birikiminin anlamlı şekilde arttığını gösterdi ve bu da daha yüksek fibroz puanlarını gösteriyor. Deksametazon tedavisi, SHIP eksikliği olan farelerde fibrozisi belirgin şekilde azaltmış ve skorları SHIP-pozitif kontrollere yaklaştırmıştır. Alcian mavisi ve PAS boyama, SHIP eksikliği olan farelerde goblet hücresi hiperplazisini doğruladı ve deksametazon tedavisinden sonra bu durum gözle görülür şekilde azaldı.

SHIP-eksitli farelerde IL-1 beta konsantrasyonları, SHIP kontrollerine göre anlamlı şekilde yüksekti. Deksametazon ise SHIP eksikliği olan farelerde IL-1beta konsantrasyonlarını anlamlı şekilde azaltmıştır. MPO konsantrasyonları, SHIP eksikliği olan farelerde SHIP kontrollerine kıyasla anlamlı şekilde yükselmişti ve bu artış, istatistiksel anlamlılığa ulaşmadan deksametazon ile azaltıldı.

LCN-2 konsantrasyonları SHIP eksikliği olan farelerde de yükselmişti, ancak deksametazon ile yüksek değerler tutarlı şekilde azalmadı. IL-1 beta konsantrasyonları, histolojik hasar puanları ve fibroz skorları ile pozitif korelasyonda, iltihap ile doku hasarı arasında bir bağlantı olduğunu göstermektedir. Histolojik hasar puanları, fibroz skorlarıyla pozitif korelasyon göstermekteydi; bu da doku hasarı ile fibrotik yeniden şekillendirmenin paralel ilerlediğini göstermektedir.