Floresan Polistiren Mikrosferleri Kullanarak In Vivo İki Foton Mikroskopi İçin Mikrovasküler Embolizm Fare Modeli

Bu mikrosfer enjeksiyon yöntemini kullanarak, beyin kapiler ağında embolüsün temizlenmesinin potansiyel mekanizmalarını incelemek için kapiler tıkamaların kısa ve uzun vadeli sonuçlarını çözmeyi hedefliyoruz. Kortikal kapiler ağındaki floresan parçacıkların gerçek zamanlı in vivo görüntülemesi ve takibi mümkün olur. Mikroküreler ve yerel sonuçlar enjeksiyondan sonra haftalarca takip edilebilir.

Çalışmalarımız, mikrovasküler tıkanıklıklar nedeniyle oluşan yerel doku hasarını anlamaya yardımcı olur. Bu sonuçlar umarız yeni tedavi stratejilerine yol açabilir. Artık gün gün ve haftalarca kapiller tıkamaların damarları nasıl değiştirdiğini, hücreleri aktive ettiğini, kan akışını nasıl değiştirdiğini ve kan-beyin bariyerini nasıl etkilediğini inceleyebiliyoruz.

Başlamak için, anestezi derinliğini doğrulamak için anestezi altındaki farenin parmağını çimdikleyin. Cerrahi makas ve diseksiyon forsepsiyle mandibulanın altındaki trakea üzerinde yaklaşık 0,5 santimetre orta hat kesisi yapın. Servikal fasyaya yüzeysel bağ dokusunu mikro dikiş bağlayıcı penseps kullanarak alt altında yatan sternal hyoid kasları ortaya çıkarmak için disseksiya yapın.

Şimdi, sol ve sağ göğsüň hyoid kaslarını aralarındaki bağ dokusunu nazikçe yırtarak ayırın. Sağ omohyoid kası doku kancası ile kaudal-lateral olarak geri çekin. Sağ karotis üçgenin, ortak karotis arter, iç karotis arteri ve dış karotis arter dahil olmak üzere net göründüğünden emin olun.

Sonra, ortak karotis arteri çevreleyen kalan fasya ve yağ dokusunu çıkarın. Ortak karotis arterini vagus sinirinden dikkatlice ayırın. Ortak karotis arterinin etrafına iki adet 4/0 1.5 ip yerleştirin ve bunları gevşekçe bağlayın, böylece düğümlerin kan akışını engellemediğinden emin olun.

Dahili karotis arter ve arka parietal arterden fasya ve yağ dokusu çıkarın. Daha sonra arka parietal arteri ve oksipital arter dahil tüm iç karotis yan dalları geçici olarak 4/0 1.5 iplikle bağlayarak bağlanın. Dış karotis arter ve temporal arterden fasya ve yağ dokusu alın.

Dış karotis arteri ve temporal arterin etrafına 4/0 ölçüm 1.5 ipliklerle iki gevşek düğüm yerleştirin. En distal ipliği Y şeklindeki bifurkasyondan mümkün olduğunca uzak konumlandırın ve dış karotis arter ile temporal arterayı kalıcı olarak bağlayın. Proksimal düğümü çözmeden bırakın.

10 mikrometrelik mikroküreleri homojenize edin ve sonikleştirerek bireysel parçacıkların eşit bir askıya alınması elde edin. 140 mikrolitre FITC-Dextran'a 20 mikrolitre homojenize mikrosfer eklenirken, 1,44 kat 10 mikrosferin gücünde 160 mikrolitre karışım hacmi elde edilir. Katetere bağlı şırıngayı kısa bir süreliğine geri çekerek bir hava kilidi oluşturun.

Sonra kateter ucunu hazırlanmış FITC-Dextran/Tween20/mikroküre karışımına daldırın ve şırıngayı yavaşça geri çekerek karışım katetere girene kadar kullanın. Kateterde hava kabarcıkları olmadığından emin olun. Şırıngayı yüklü kateterle birlikte şırınga pompasına yerleştirin.

Pompayı dakikada 10 mikrolitre ayarlayın ve kateter ucunda küçük bir mikroküre karışımı damlası oluşana kadar çalıştırın. Şimdi, damar damarı damar damarının iç damar damarına yerleştirin ve ortak karotis arterinin etrafındaki önceden hazırlanmış proksimal düğümlerden birini sıkın. Mikro-makas kullanarak, ligasyon ipliğinden yaklaşık 0,5 milimetre uzakta dış karotis arterinde küçük çapraz bir kesi yapın; böylece kesi boyutunun kateter çapından biraz daha küçük olmasını sağlayın.

Kanı steril bir bezle em. Kateter ucunda bir damla mikroküre karışımı oluşturmak için şırınga pompasını kısa süreliğine çalıştırın, böylece kateter ucunda hava kalmadığını doğrulayın. Dış karotis arter kesisini açın ve kateteri ince mikroforseps ile yerleştirin.

Sonra, kateteri dış karotis arteri etrafındaki proksimal dikişi sıkılaştırarak dış karotis arterine sabitleyin. Yavaşça dakikada 10 mikrolitre pompalayın, ta ki arter gözle görülür şekilde büyüyüp yeşil FITC boyası dış karotis arterini doldurana ve başarılı enjeksiyon teyit edilene kadar. Sonra, damar klipsini iç karotis arterinden çıkarın.

Sonra şırınga pompası akışını dakikada 20 mikrolitre çıkarın. Başarılı mikrosfer enjeksiyonunu doğrulayın; iç karotis arteriyanın posterior parietal arter bifurkasyonuna distal olarak FITC boyası ile dolu olduğunu doğrulayın. Enjeksiyon başarılı olduğunda, ortak karotis arterini bağlayan ipliği çıkararak mikrosfer karışımının iç karotis arterine akmasını sağlar.

Enjeksiyon sırasında, FITC boyası dış karotis arterinde hâlâ gözlemlenebilir. Kateterdeki karışım 80 mikrolitre işaretine ulaştığında enjeksiyonu durdurmak için şırınga pompasını kapatın. Sonra ortak karotis arterini bağlayın, iç karotisi kesin ve kateteri nazikçe çıkarın, böylece sabitleme ipliği yerinde kalsın.

Kateteri sabitleyen ipliği sıkararak dış karotis arterini kalıcı olarak bağla. Kan akışını yeniden sağlamak için damar klipsi ve ortak karotis arter, iç karotis arteri ve arka parietal arterin çevresindeki iplikleri çıkarın. Mikrovasküler embolizm ameliyatının başarısı, ameliyattan dört gün sonra tam vücut ve tam beyin otopsi in situ görüntüleme ile doğrulandı.

Sagittal beyin kesiminde mikrokürelerin beyinde yerleştiği görüldü. Ameliyattan bir gün sonra görüntülenen fare beyinleri ultrasonda, mikrokürelerin ağırlıklı olarak ipsilateral yarımkürede orta ve ön beyin arterlerinin akış bölgesinde yerleştiğini gösterdi. Beyin dilimlerindeki mikrosfer sayıları, Tween20 mikrosfer karışımına eklendiğinde önemli ölçüde arttı.

Fareler, Tween20 içeren bir mikroküre karışımı enjekte edildiğinde ameliyattan sonra daha az kilo verdi ve daha hızlı iyileşti. Ameliyattan 0,5 saat sonra alınan beyin korteksinin floresan mikroskopik görüntülerinde, kapilyarları kapatan mikroküreleri temsil eden bireysel beyaz noktalar görüldü. İki fotonlu z-yığını projeksiyon görüntüleri, mikrokürelerin perfüzyon bozulmuş beyin mikrovasküler embolizmlerine neden olduğunu gösterdi.

Embolizmler ayrıca damarlardan görünür bir boya sızmasıyla kan-beyin bariyerinin bozulmasına neden olur.