Doğal Deniz Deniz Suyu İnokulum ve Kapalı Döngü Respirometre Kullanılarak Malzemelerin Aerobik Biyolojik Bozunma Testi

Araştırmamız, veri karşılaştırması için doğal deniz suyu aşısı kullanarak deniz ortamındaki aerobik biyodegradasyon oranını ve doğal malzemelerin derecesini nicelikle ölçülür. Mevcut deneysel zorluklarımız, sınırlı test kapasitesi ve biyodegradasyon testine artan talebi karşılayacak altyapı eksikliği ile laboratuvarlar arasında eşit ve şeffaf yöntemlerin sağlanmasını içermektedir. Başlamak için, büyük bir Niskin şişesi kullanarak 20 litrelik asit sızdırılmış bir karboya 10 ila 20 litre deniz suyu toplayın.

Dolu vagonu laboratuvara geri taşıyın. Karbodan bir litre tüm deniz suyunu, partikül karbon ve azot analizi için asit sızanmış, bir litrelik kehribar HDPE şişesine aktarın. 0,2 mikrometrelik, düşük azotlu selüloz asetat membranından filtreleyin.

Şimdi, bir, iki veya dört litrelik hacimsel bir şöleyi yarı yarıya deniz suyu ile doldurun. Eğer deniz suyu yüksek partikül organik madde içeriyorsa, büyük heterojen parçacıkları çıkarmak için 20 mikrometrelik bir ağdan süzerek alın. Sonra 60 mililitre filtratı asitle süzülen polietilen şişesine toplayarak çözünmüş inorganik ve organik azot ve fosfor analizi yapılır.

Karboy'nun açıklığını gevşekçe kapatarak aerobik koşullara izin verin. Karanlıkta 30 derece Celsius'ta yedi güne kadar saklanın. Sonra, deneysel substrattan 10 ila 15 gramı 50 mililitrelik paslanmaz çelik frezeleme kavanozuna yerleştirin.

20 milimetrelik çelik bir top ile. Öğütme kavanozunu 15 dakika sıvı azotla batırarak kırılganlaştırın. Frezeleme kavanozunu bilyalı değirmen bağlantısına sabitleyin.

Sonra aleti 30 hertz ve iki dakika 30 saniyeye ayarlayın ve başlat tuşuna basın. Her döngü arasında sıvı azotta 30 saniye soğutma ile dört kez frezeleme yapın. Testin başlanmasından önce substratı 0,10 ile 0,25 milimetre arasında eşit bir parçacık boyutuna getirin.

0,001 gram hassasiyetli hassas bir denge kullanarak, amonyum klorür litresi başına 0,5 gram ve monobazik potasyum fosfatı litresi başına 0,1 gram tartınız. Inorganik besinleri şişeye ekleyin. Deniz suyu kullanarak hacmi işaretleyin.

Sonra bir karıştırma çubuğuna koyup tüm tuzlar eriyene kadar bir tabakta karıştırın. Analitik bir turuşmada, deneysel veya kontrol substratından 20 miligram tartın. Tam okuma ağırlığını kaydedin ve şişeni bir kenara koyun.

Reaktör kaplarını kurmak için, motorlu pipet kontrolcüsüyle asitle sızan, 75 mililitrelik hacimsel pipet kullanın ve deniz suyunu aspire ederek her reaktör kabına besin takviyeli deniz suyunu 75 mililitre dağıtın. Her bir gemiden yaklaşık üç mililitre deniz suyu çıkarın. Sonra kabın yanındaki temiz bir yüzeye koyarak yırtık şişeden frezlenmiş alt tabakayı durulayın.

Şimdi frezenmiş substratı, yırtık şişeden ilgili reaktör kabına aktarın. Reaktör kabının kenarına bir O-ring yerleştirin. Sonra O-ring'in üzerine iki portlu bir kapak yerleştirip vida kapakla sabitleyin.

Her reaktör kabını uyumlu gaz veya yoğuşma hatlarına bağlayın. Gaz hatlarını kapağın uygun giriş ve çıkış portlarına sıkıca takın. Shaker platformunu sürekli modda 0.05G'ye açın.

Tüm kapların güvenli olduğundan görsel olarak kontrol edin, ardından kuluçka kapağını kapatın. Enstrüman yazılımında Deney'e gidin ve Kurulum'a tıklayın. Açılır menülerden başlangıç ve son kanal numaralarını işgal edilmiş kanallara karşılık gelen menülerden girin.

Yenileme eşiğini 0.50 olarak ayarlayın. Aralıkları NA'ye ve pencereyi otomatik olarak yenile. Sonra Çeşitli Kurulum altındaki temizlik sensörleri kutusunu işaretleyin.

Otomatik Hacim Ölçümü, Oksijen Tüketimi Pozitif ve Açık Akış Modu Etkinleştir seçeneklerinin seçilmediğinden emin olun. Örnekleme aralığını 8.00 olarak ayarlayın. Sonra gaz ve zaman birimlerini gerektiği gibi ayarlayın.

İnkubasyon sıcaklığı düzeltmesi için birincil sıcaklık probu kullanıyorsanız, Manuel Giriş Odası Sıcaklıkları seçeneğinin seçilmediğinden emin olun. Havalandırma Modu kutusunu işaretleyin ve Tahliye Modu'nun seçilmediğinden emin olun. Şimdi, Chamber Setup'u seçin ve tanımlayıcı kanal etiketlerini girin.

Eğer sızıntı belirtilmişse, O-ringin temiz, oturmuş ve partikül veya liflerden arınmış olduğundan emin olun. Vida kapağını sık. Giriş ve çıkıştaki boru bağlantılarını kontrol edin.

Aşınmış veya deforme olmuş boru uçlarını keskin bir bıçakla keserek temiz kesimler elde edin. Menüden Araçlar'ı seçin, ardından Servis Menüsü'ne tıklayın ve birincil sıcaklık probun 30 derece Celsius (iki derece varyasyonu) ve stabil olduğunu doğrulayın. Deneyi başlatmak için Run tuşuna tıklayın.

Deney dosyasını tarih dahil olmak üzere tanımlayıcı bir isim altında kaydedin ve dosya adını veri sayfasına kaydedin. 84 gün boyunca birikimli karbondioksit üretimi beklenen performansı doğruladı. 84 gün boyunca, selüloz kısa bir gecikmeden sonra hızlı karbondioksit üretimi gösterdi ve yaklaşık 700 mikromol seviyesine ulaştı.

PHA, üç gün boyunca daha yavaş bir başlangıç oranı gösterdi. Ve deniz suyu kontrolü 150 mikromol olarak düşük kaldı. Bireysel negatif kontrol kopyaları düşük değişkenlik gösterdi ve tüm eğriler birbirine yakın kaldı.

Selüloz pozitif kontrol çoğaltımları tutarlı olarak düşük değişkenlik gösterdi ve dört replikanın tamamında istikrarlı performans doğruladı. Negatif sonuç veri setinde, kopya beş, muhtemelen değişken organik maddeden kaynaklanan karbondioksit üretim hızında anormal bir sıçrayış gösterdi, ancak kümülatif üretimi 100 mikromol seviyesinde sabit durmaya başladı. Kopya yapılan her altıda birinin diğerlerine göre daha düşük kümülatif karbondioksit üretimi olması olası teknik sorunlara işaret ediyordu.

Negatif kontrolde ortalama kümülatif karbondioksit üretiminin standart hatası %2,5 olup, çoğaltıcılar arasında düşük değişkenliği gösteriyor. Selüloz pozitif kontrol için standart hata %0,83 olup, biyodegradasyon testinin yüksek tekrarlanabilirliğini daha da doğrulamıştır. PHA, pozitif kontrole yakın yüksek mineralizasyona sahiptir ve kontrol hatasına benzer bir standart hataya sahiptir.

Bu protokol, endüstri, akademi ve düzenleyici kurumlar için deniz ortamında malzemelerin biyobozunabilirliğini taramak için standartlaştırılmış erişilebilir yöntemlerdeki boşluğu ele almaktadır. Protokol, bu biyodegradasyonu doğrudan ölçmek için daha hızlı ve standartlaştırılmış bir yol sunar; eşzamanlı örnek değerlendirmesinde daha kısa test süresi vardır. Protokol, makine öğrenimi ve malzeme performansının öngörülebilir modellemesi için materyal ve laboratuvar karşılaştırılabilirliği için yüksek verimli standartlaştırılmış testler sağlar.