Amiloid ve Çapraz Beta Mimarisi

Araştırmamız, çapraz beta amiloid fibril yapısını ve moleküler organizasyonunu incelemek için X-ışını lifi kırınımı kullanır. Bu protokol, çapraz beta desenlerini doğrulamak ve fibril mimarileri aydınlatmak için X-ışını fiber kırınımı kullanır. Bu protokol, amiloid fibrillerin yapısal analizini, çapraz beta organizasyonunu doğrulamaktan daha fazla moleküler detayın aydınlatılmasına kadar mümkün kılar.

Başlangıç olarak, protein veya peptid fibrillerini hizalayarak lif eksenleri ideal olarak tamamen paralel olan bir demet oluşturun. Mum mumunu sıcak bir plakayla eriterek sıvılaşana kadar erit. Cam kesici kullanarak, 1 milimetrelik borosilikat cam kapillyarları yaklaşık 2-3 santimetre uzunluğunda kesin.

Kesilen kapilyarları kısa bir süre sıvı muma daldırın. Sonra mum balmumunu kapiler hareketiyle yaklaşık 1-2 milimetreye kadar yukarı çekin. Şimdi plastilen kullanarak kapalı kapillyarları bir Petri kabının içine yatay olarak sabitleyin.

Kabillaryların mumla dolu uçları arasında 0,5-2 milimetre boşluk bırakın. Bir pipet ile, iki kapilyarın mum dolu uçları arasına dikkatlice 10 mikrolitrelik fibril çözelti damlası asın. Petri kabını tozdan korumak için kaplayın ve gece boyunca buharlaşmasına izin verin.

Sonra kontrollü bir kurutma ortamı sağlamak için plakayı sızdırmaz. Amiloid fibrilleri cam bir kapillerde hizalamak için, 0,7 milimetre çapında silikonlu cam kapiler geniş ucuna kauçuk boru olan 1 mililitrelik bir şırınga sabitleyin. Kapillere 2-3 santimetre fibril süspansiyon aspirasyon verin.

Kapillerin bir ucunu erimiş balmumu ile kapatın, diğer ucunu ise buharlaşmaya izin vermek için açık bırakın. Kapilleri dikey olarak düzenleyin ve kurumuş bir disk oluşana kadar kurumasına izin verin. Fibrilleri mat veya ince film olarak hizalamak için, yüksek konsantrasyonlu bir fibril örneği cam slayta yerleştirin ve 24 saat boyunca hava kurutmadan önce kaplayın.

Fibril demetini dikkatlice bir goniyometre başlığına monte edin ve X-ışını demetten geçecek şekilde yönlendirin. Fibril mat örneği kullanıyorsanız, X-ışını ışını ışınının matın kenarından geçeceği şekilde yönlendirin. Örneği çapraz polarizatör ile donatılmış bir ışık mikroskobu altında inceleyerek çift kırılmayı gözlemleyin.

Numuneyi X-ışını ışınına fiber demet, mat veya disk olup olmadığına göre konumlandırın. Kendi içi X-ışını ekipmanı veya sinkrotron radyasyonu kullanarak bir kırınım desenini toplayın. Veri analizi yapmak için dosyayı CLEARER kırınım desen analiz yazılımına yükleyin.

Kırınım Deseni ve Kırınım Ayarı'na geçin, piksel boyutu, X-ışını kaynağı ve örnek dedektör mesafesi gibi kırınım ayarlarını girin. Image Processing tuşuna tıklayın ve Döndürerek kırınım görüntüsünü meridyen dikey hale getirin. Merkezleme modülünü kullanarak Kırınım Desenine gidip Merkez Görüntü'ye tıklayarak görüntüyü ortalayın.

Meridyen ve ekvator eksenlerini tanımlayın. Merkezlenmiş görüntüyü sonraki analiz için kaydedin. Sonra, meridyen ve ekvator boyunca uygun bir açı belirtin.

Kırınım Sinyal Konumu grafiği oluşturmak için Kırınım Desenine ve ardından Radyal Ortalama modülüne tıklayın. yoğunluk karşısında. Kırınım sinyalini ölçmek ve otomatik olarak çıkarmak için Difraksiyon Deseni menüsünden Peak Find modülüne gidin.

Gerçek sinyalleri gürültü olmadan tespit etmek için tepe arama genişliğini ayarlayın. Kırınım sinyalinin konumunu tepe bulgu kullanarak doğrulamak için zoom ve ölçü seçeneğini kullanın. Birim Hücre Optimizasyonu modülünü kullanarak potansiyel birim hücre boyutlarını keşfedin.

Güçlü ekvator sinyallerine dayalı ilk tahminleri girin ve hücre araması için minimum ve maksimum indeksleri tanımlayın. Potansiyel birim hücre boyutlarını hesaplayın ve tahmin edilen kırınım sinyal pozisyonlarını gözlemlenen yansımalarla karşılaştırın. Veriye ve numuneye en uygun birim hücresini seçin.

Moleküler modeller oluşturmak için, belirlenen birim hücreye uyan beta sayfa konfigürasyonunda peptitlerin 3D düzenlemelerini oluşturun. Tüm simetri ile ilgili bileşenlerin dahil edilmesinden emin olun. Sonra, Difraksiyon Simülasyonu'na ve ardından Yapılar ve Yapı Zinciri Oluşturucu'ya tıklayarak PDB modelini yükleyin.

Fiber ekseni ve ışın eksenini atayın, giriş ünitesi hücre boyutlarını belirleyin ve ardından sterik çarpışmaları kontrol edin. Kırınım Simülasyonu'na gidin ve PDB koordinatlarını Fiber Diffraksiyon Simülasyonu modülüne yüklemek için Fiber Diffraction Simulation'a tıklayın. Fiber eksen yönünü, ışın yönü, birim hücre boyutları, X-ışını kaynağı ve dedektör ayarlarını girin, ardından simülasyonu çalıştırmak için Simülasyon tuşuna tıklayın.

Işin ekseninin fiber eksenine dik olduğundan emin olun. Sonra Dosya'ya gidin ve Save As seçeneğine tıklayın, böylece simülasyon ayarlarını daha sonra düzenlemek için html dosyaları olarak kaydedebilirsiniz. Simüle edilen kırınım desenini RAW formatında veya TIFF dosyası olarak kaydedin.

Simüle edilen deseni deneysel kırınım deseniyle karşılaştırın. Aynı analiz iş akışını kullanarak simüle edilen kırınım sinyallerini ölçmek. Bu değerleri kaydedin ve deneysel verilerle karşılaştırın.

Elektron mikrografları, ızgarada X-ışını lifi örneği hazırlamak için uygun yüksek yoğunlukta amiloid fibriller gösterdi. Esneme çerçevesi hizalı lifler, 4.76 angstromda meridinal yansıma ve zincir uzunluğu, levha aralığı ile protofilament boyutundan kaynaklanan ekvator yansımalarıyla karakteristik çapraz beta kırınım deseni üretti. İdealize edilmiş bir çapraz beta kırınım desen, meridinal ve ekvatoryal yansımaların fiber eksenler boyunca tekrarlayan aralıklara karşılık geldiğini göstermiştir.

İyi merkezlenmiş bir kırınım deseniyle simetrikti ve ekvator ile meridinal zirveler üst üste biniyordu. Kırınım zirveleri otomatik olarak tespit edilip zirve bulgu analiziyle listelendi. Tespit edilen kırınım tepeleri, makul birim hücre boyutlarını belirlemek için kullanıldı.

Tanımlanan birim hücresi kullanılarak yapısal bir model hazırlanmış ve kırınım simülasyonu öncesinde görselleştirilmiştir. Önerilen yapısal modelden elde edilen simüle edilmiş kırınım verileri, hem yansıma pozisyonlarında hem de göreceli yoğunluklarda deneysel kırınım deseniyle makul bir uyum sağladı. Simüle edilmiş ve deneysel kırınım desenlerinin üst üste bindirilmesi, karşılık gelen yansımaların hizalandığını daha da göstermiştir.

Doğru örnek hizalanması kritik öneme sahiptir çünkü kırınım verisinin kalitesini ve ondan elde edilebilecek bilgiyi belirler. Bu çalışma, atomik çözünürlüklü yapısal modelleme ve AFM gibi diğer yapısal tekniklerle entegrasyonu sağlayarak ayrıntılı moleküler yapıları mümkün kılmaktadır.