Name: GMP ölçeklenebilir cihazlarda CAR-T ve sitokin kaynaklı katil hücrelerin verimli ve hızlı üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-05T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Öğrenin, G-Rex cihazlarında CAR-T ve CIK hücrelerinin GMP ölçeklenebilir üretim yöntemini. Bu protokol, yüksek yoğunluklu kültürlerde minimal kullanıcı müdahalesiyle klinik uygulama için hücre terapisi ürünlerinin verimli genişlemesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer+as+personalized+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer.</a> Science. 348 (6230), 62-68 (2015).</li>
<li>Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">NK cells for cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).</li>
<li>Cappuzzello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+cytokine-induced+killer+cells+overcome+CAR-T+cell+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">How can cytokine-induced killer cells overcome CAR-T cell limits.</a> Front Immunol. 14, 1229540(2023).</li>
<li>Sharma, A., Schmidt-Wolf, I. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((30+years+of+CIK+cell+therapy%3A+Recapitulating+the+key+breakthroughs+and+future+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">30 years of CIK cell therapy: Recapitulating the key breakthroughs and future perspective.</a> J Exp Clin Cancer Res. 40, 388(2021).</li>
<li>Bayatipoor, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+NKT+cells+in+cancer+immunotherapy-from+bench+to+bed%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Role of NKT cells in cancer immunotherapy-from bench to bed.</a> Med Oncol. 40, 29(2022).</li>
<li>Hayday, A., Dechanet-Merville, J., Rossjohn, J., Silva-Santos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+by+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy by γδ T cells.</a> Science. 386, 6717(2024).</li>
<li>Rohaan, M. W., van den Berg, J. H., Kvistborg, P., Haanen, J. B. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+melanoma%3A+A+viable+treatment+option%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes in melanoma: A viable treatment option.</a> J Immunother Cancer. 6, 102(2018).</li>
<li>June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li>
<li>Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+T+cells%3A+The+promise+and+challenges+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engineered T cells: The promise and challenges of cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 16, 566-581 (2016).</li>
<li>Zhang, J., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+world+of+TCR-T+cell+trials+against+cancer%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Technol+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">The emerging world of TCR-T cell trials against cancer: A systematic review.</a> Technol Cancer Res Treat. 18, 1533033819831068(2019).</li>
<li>Sadelain, M., Brentjens, R., Rivière, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+principles+of+chimeric+antigen+receptor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">The basic principles of chimeric antigen receptor design.</a> Cancer Discov. 3 (4), 388-398 (2013).</li>
<li>Cappuzzello, E., Sommaggio, R., Zanovello, P., Rosato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+for+the+induction+of+antitumor+effectors%3A+The+paradigm+of+cytokine-induced+killer+%28CIK%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of cytokine-induced killer (CIK) cells.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 36, 99-105 (2017).</li>
<li>Palmerini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum-free+protocol+for+the+ex+vivo+expansion+of+cytokine-induced+killer+cells+using+gas-permeable+static+culture+flasks%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A serum-free protocol for the ex vivo expansion of cytokine-induced killer cells using gas-permeable static culture flasks.</a> Cytotherapy. 22 (9), 511-518 (2020).</li>
<li>Pietà, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+therapeutic+strategy+for+B-cell+malignancies+that+combines+obinutuzumab+and+cytokine-induced+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Innovative therapeutic strategy for B-cell malignancies that combines obinutuzumab and cytokine-induced killer cells.</a> J Immunother Cancer. 9, e002475(2021).</li>
<li>Pievani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-functional+capability+of+CD3%2BCD56%2B+CIK+cells%2C+a+T-cell+subset+that+acquires+NK+function+and+retains+TCR-mediated+specific+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dual-functional capability of CD3+CD56+ CIK cells, a T-cell subset that acquires NK function and retains TCR-mediated specific cytotoxicity.</a> Blood. 118 (12), 3301-3310 (2011).</li>
<li>Cappuzzello, E., Tosi, A., Zanovello, P., Sommaggio, R., Rosato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retargeting+cytokine-induced+killer+cell+activity+by+CD16+engagement+with+clinical-grade+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22OncoImmunology%22%5BJournal%5D)">Retargeting cytokine-induced killer cell activity by CD16 engagement with clinical-grade antibodies.</a> OncoImmunology. 5, e1199311(2016).</li>
<li>Rambaldi, B., Rizzuto, G., Rambaldi, A., Introna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+and+unmodified+cellular+approaches+to+enhance+graft+versus+leukemia+effect%2C+without+increasing+graft+versus+host+disease%3A+The+use+of+allogeneic+cytokine-induced+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetically modified and unmodified cellular approaches to enhance graft versus leukemia effect, without increasing graft versus host disease: The use of allogeneic cytokine-induced killer cells.</a> Front Immunol. 15, 1459175(2024).</li>
<li>Rotte, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-response+correlation+for+CAR-T+cells%3A+A+systematic+review+of+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dose-response correlation for CAR-T cells: A systematic review of clinical studies.</a> J Immunother Cancer. 10, e005678(2022).</li>
<li>Zhang, Y., Schmidt-Wolf, I. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-year+update+of+the+international+registry+on+cytokine-induced+killer+cells+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ten-year update of the international registry on cytokine-induced killer cells in cancer immunotherapy.</a> J Cell Physiol. 235 (12), 9291-9303 (2020).</li>
<li>Garcia-Aponte, O. F., Herwig, C., Kozma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+expansion+in+bioreactors%3A+Upgrading+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte expansion in bioreactors: Upgrading adoptive cell therapy.</a> J Biol Eng. 15, 13(2021).</li>
<li>Smith, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+expansion+in+a+Xuri+Cell+Expansion+System+W25%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell expansion in a Xuri Cell Expansion System W25.</a> Methods Mol Biol. 2086, 151-163 (2020).</li>
<li>Ludwig, J., Hirschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+process+optimization+for+large-scale+CAR+T+expansion+using+the+G-Rex+cell+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods and process optimization for large-scale CAR T expansion using the G-Rex cell culture platform.</a> Methods Mol Biol. 2086, 165-177 (2020).</li>
<li>Vera, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+%28G-Rex%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex).</a> J Immunother. 33, 305-315 (2010).</li>
<li>Bajgain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+production+of+suspension+cells+using+the+G-Rex+%26%2334%3BM%26%2334%3B+series%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex &#34;M&#34; series.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14015(2014).</li>
<li>Talleur, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+CD27-depleted+cells+in+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cell+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Allogeneic CD27-depleted cells in adoptive cell therapy.</a> Adv Cell Gene Ther. 2, e45(2019).</li>
<li>Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+optimal+cytotoxic+activity+of+human+HER2%2Fneu-specific+CD8+T+cells+by+comparing+the+Cr-51+release+assay+to+the+xCELLigence+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Determining optimal cytotoxic activity of human HER2/neu-specific CD8 T cells by comparing the Cr-51 release assay to the xCELLigence system.</a> J Vis Exp. (66), e3683(2012).</li>
<li>Eberhardt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+serum-free+media+on+the+expansion+and+functionality+of+CD19.CAR+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of serum-free media on the expansion and functionality of CD19.CAR T-cells.</a> Int J Mol Med. 52, 58(2023).</li>
<li>Cadiñanos-Garai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+temporal+mapping+of+CAR+T+cells+reveals+phenotypic+and+functional+remodeling+during+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing.</a> Mol Ther. 33, 2291-2309 (2025).</li>
<li>Wang, X., Byrne, M. E., Liu, C., Ma, M. T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+process+development+of+NK+and+CAR-NK+expansion+in+a+closed+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Scalable process development of NK and CAR-NK expansion in a closed bioreactor.</a> Front Immunol. 15, 1412378(2024).</li>
<li>Noldner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+lung+cancer+tumor-infiltrating+lymphocyte+%28TIL%29+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Improving lung cancer tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) manufacturing.</a> Cytotherapy. 27, 1240-1250 (2025).</li>
<li>Bandeira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+processing+of+lentiviral+vectors%3A+Releasing+bottlenecks%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Downstream processing of lentiviral vectors: Releasing bottlenecks.</a> Hum Gene Ther Methods. 23, 255-263 (2012).</li>
</ol>

Benimseyen hücre tedavisi (ACT), kanser tedavisinde ileri tedavilerin önemli bir direği haline gelmiştir. Bu yaklaşım, anti-tümör etkinliğini sağlamak için ex vivo genişletilmiş hücresel ürünlerin uygulanmasınadayanmaktadır 1. Bugüne kadar, ACT'de birçok hücre tipi kullanılmıştır; örneğin, doğal katil (NK)2, sitokin kaynaklı katil (CIK)3,4, doğal öldürücü T (NKT)5 veya γδ Thücreleri 6, tümör sızdıran lenfositler (TILs)7 ve mühendislik hücre tabanlı tedaviler gibi çok spesifik ve kişiselleştirilmiş yöntemlere (örneğin kimerik antijen reseptörü (CAR)1, 8 ve T hücre reseptörü (TCR)hücreleri 9,10.
CAR-T hücreleri, belirli bir moleküler hedefi tanımak için tasarlanmış sentetik bağışıklık reseptörünü ifade etmek için ex vivo viral transdüksiyonla üretilen genetik olarak modifiye edilmiş T hücreleridir. CAR yapısı, antijene özgü tek zincirli değişken Fragment (scFv) antikoru ile TCRζ zinciri ve kostimulyatör moleküller dahil olmak üzere hücre içi sinyal alanları ile birleşir. Antijen etkileşimi olduğunda, hücre içi alan T hücresi çoğalmasını ve antitümör aktivitesini teşvik eden aktivasyonsinyalleri iletir.
CIK hücreleri, periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC) veya göbek kordonu kanından (UCB) ex vivo genişleme sırasında CD56 ekspresyonunu elde eden aktife T lenfositlerinin heterojen bir popülasyonudur. Bu genişleme, Interferon-γ (IFN-γ), anti-CD3 monoklonal antikor ve Interleukin-2 (IL-2) ile uyarılmayı, ardından 14 gün boyunca IL-2'de kültürü içerir. CIK hücreleri işlevsel olarak hem NK hem de T hücrelerine benzer; hem ana histokompatibilite kompleksi (MHC)-bağımsız hem de bağımlı mekanizmalar aracılığıyla antitümöraktivitesi uygularlar 13,14,15,16. Bu özellikler, CIK hücrelerinin hem allogen hem de otolog terapötik ortamlarda kullanılmasını sağlar ve en az greft-konak hastalığı (GvHD)riski 17.
Klinik uygulamada, hem CAR-T hem de CIK hücre tedavileri çok sayıda hücre uygulanmasını gerektirir. CAR-T hücreleri, hasta başına 50-200 milyon dozdaenfuze edilir 18. Benzer şekilde, CIK hücreleri genellikle her infüzyon başına 10 milyar hücreye kadar dozda verilir ve hastalar genellikle tedavi protokolüne bağlı olarak birden fazla infüzyon alır19. Şişe veya plaka kullanılarak yapılan geleneksel hücre kültürü yöntemleri verimsizdir, zaman alıcıdır ve sık geçiş gerektirir; bu da büyük ölçekli genişlemeyi mümkün kılmaz ve kontaminasyon riskini artırır. Torba kültürleri veya biyoreaktörler kullanan otomatik veya yarı otomatik sistemler, büyük ölçekli genişlemeye olanak tanır ancak sınırlamaları vardır; örneğin, kesme gerilimi veya yoğunluk ayarlamaları ve sık sık ortaperfüzyon (20,21) ile aynı anda bir partinin işlenmesi gibi sınırlamalar vardır; bu da hem akademik hem de endüstriyel bağlamlarda yüksek maliyetlere yol açar. Bu zorlu durumda, alternatif olarak gaz geçirimli hızlı genleşme (G-Rex) cihazı temsil edilir; bu, kuyunun dibinde silikon membran bulunan statik bir kültür yöntemidir; bu yöntem, verimli oksijen değişimini ve damarların yüksekliğini artırır ve yüksek hacimli orta kapasiteye olanak tanır. Böylece sistem, orta iplasman veya yoğunluk ayarlaması olmadan hücrebüyümesini destekler 22,23. G-Rex-M sistemleri, 5000 mL'ye kadar ölçeklenebilirlik göstermiş olup, otomatik hasat sistemleriyle uyumludur; bu da gelişmiş terapi tıbbi ürünlerinin (ATMP) geliştirilmesi için akademik ortamlardan kliniklere kolayca dönüştürülebilecek, kontaminasyonsuz ve kapalı kültür platformu sağlar.24.
Özetlenen prosedürde, hem CAR-T hem de CIK hücrelerinin genişleme protokolünü optimize etmek için G-Rex cihazlarının avantaj ve özelliklerinden yararlandık. Her iki hücre tipinin de verimli şekilde genişletilebileceğini, farklı kültür sistemlerinde tutarlı fenotip ve fonksiyonel profil korunabileceğini gösterdik. Hem CIK hem de CAR-T hücreleri için genişleme protokolünün şematik bir özeti Şekil 1'de gösterilmiştir.
<img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Şekil 1: G-24 veya G-6M kültür cihazları kullanılarak CAR-T ve CIK hücre genişletme protokollerinin genel görünümü. CAR-T ve CIK hücreleri, 0. günden itibaren izole PBMC'lerden genişletilir. CAR-T hücrelerinin genişlemesi için, PBMC'ler 1. günde anti-CD3 ve anti-CD28 antikorlarıyla uyarılır, 2. gün genetik olarak mühendislik edilir ve ardından her 3-4 günde bir hIL-7 ve hIL-15 takviyesi ile kültürlenir; fonksiyonel testler için son hasat 9. günde yapılır. G-6M formatında, sitokin takviyesi 2. günle sınırlıdır ve kültür dönemi boyunca ek sitokin beslemesi gerekmez. CIK hücrelerinin genişlemesi için, PBMC'ler 1. günde rhIFN-γ ile, 2. gün ise anti-CD3 antikor ve rhIL-2 ile uyarılır ve bu anti her 3-4 günde bir verilir. G-24'te, sitokin takviyesi ile eşzamanlı olarak orta bir değişim gereklidir. CIK hücreleri, 14. günde aşağı yönlü fonksiyonel testler için hasat edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>Parlak Leke Tamponu</td><td>BD Biosciences</td><td>566349</td><td></td></tr><tr><td>CD28 Antikor, insan karşıtı</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-375</td><td>Klon 15E8</td></tr><tr><td>CD3 Antikor, anti-insan</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-387</td><td>OKT3 Klonu</td></tr><tr><td>CD3 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>740147</td><td>Klon UCHT1</td></tr><tr><td>CD314 APC (NKG2D)</td><td>Biolegend</td><td>320808</td><td>Klon 1D11</td></tr><tr><td>CD4 BV650</td><td>BD Biosciences</td><td>563875</td><td>Klon SK3</td></tr><tr><td>CD45RA PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>563429</td><td>Clone HI100</td></tr><tr><td>CD56 PE</td><td>Biolegend</td><td>318306</td><td>HCD56 Klonu</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555543</td><td>Klon FREG-56</td></tr><tr><td>CD8 BV450</td><td>BD Biosciences</td><td>562428</td><td>Klon RPA-T8</td></tr><tr><td>CellTrace Mor Hücre Çoğalma Kiti</td><td>ThermoFisher bilimsel</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td>ThermoFisher bilimsel</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Fosfat tamponlu tuzlu (D-PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>E-plaka 16</td><td>Çevik</td><td>5469813001</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS), Değer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Düzeltilebilir Yaşam Boyası 780 (FVS780)</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>G-Rex 24 Kuyu Plakası&nbsp;</td><td>Wilson Wolf</td><td>80192M</td><td></td></tr><tr><td>G-Rex 6M Kuyu Plakası&nbsp;</td><td>Wilson Wolf</td><td>80660M</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Tampon Çözümü</td><td>Lonza</td><td>ECM0180D</td><td></td></tr><tr><td>Onun Antikoru</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-120-718</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Albümini %20</td><td>CSL Behring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan IL-15 Rekombinant Proteini</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IL-7 Rekombinant Proteini</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa X-20</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lenforep</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>18060</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>Meme kanseri hücre hattı&nbsp;</td></tr><tr><td>Penisilin ve Streptomisin</td><td>Lonza</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Fizyolojik çözelti (%0,9 Sodyum klorür)</td><td>Monico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protamin Sülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3369</td><td></td></tr><tr><td>Raji</td><td>ATCC</td><td>CCL-86</td><td>Burkitt lenfoma hücre hattı&nbsp;</td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan IFN-gamması</td><td>R& D Sistemleri</td><td>285-IF-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant IL-2 (Proleukin)</td><td>Novartis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rhCD19-His</td><td>Invitrogen</td><td>A42607</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Anı Enstitüsü 1640 (RPMI-1640)</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td></td></tr><tr><td>Stabil L-Glutamin</td><td>Lonza</td><td>ECB3004D</td><td></td></tr><tr><td>Tripan-Mavi çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence Gerçek Zamanlı Hücre Analizi</td><td>Çevik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Serumsuz hematopoietik hücre ortamı</td><td>Lonza</td><td>02-053Q</td><td></td></tr></tbody></table>

gmp ölçeklenebilir cihazlarda car-t ve sitokin kaynaklı katil hücrelerin verimli ve hızlı üretimi

Efficient and Rapid Generation of CAR-T and Cytokine-Induced Killer Cells in GMP-scalable Devices

Burada açıklanan protokol, izole edilmiş PBMC'lerden, yani CAR-T ve CIK hücrelerinden elde edilen efektör hücrelerin ex vivo genişlemesi ve mühendisliği için verimli ve sağlam bir iş akışı sağlar. Bu yöntem, minimum hücre manipülasyonu gerektirir ve G-Rex cihazlarının gaz değişim kapasitesinden faydalanır; böylece geleneksel statik kültür sistemlerine kıyasla üstün besin bulunabilirliği ve oksijenasyon sağlar23,24. Bu protokolün temel avantajlarından biri, preklinik çalışmalar için uygun olan küçük ölçekli 24 kuyuklu cihazlardan (G-24) daha büyük 6M cihazlara (G-6M) kadar (translasyonel veya klinik üretim ihtiyaçlarıyla uyumlu) ölçü orantılı ölçeklendirme dışında protokol değişikliği gerektirmeden doğal ölçeklenebilirliğidir.
Bu protokol kullanılarak, hem CAR-T hem de CIK hücreleri, 2-4. Bölümlerde açıklandığı gibi, sağlıklı donör PBMC'lerden G-24 ve G-6M formatlarında paralel olarak başarıyla genişletilmiştir. Kültür döneminin sonunda, her iki hücre tipi de yüksek katlanma genişlemesi ve canlılık sergilemiş, iki cihaz formatı arasında benzer bir çoğalma gösterilmiş (Şekil 2, Ek Tablo 1, Ek Tablo 2), bu da protokolün farklı kültür ölçeklerinde tekrarlanabilirliğini vurgulamaktadır.
Kültür cihazlarının ölçeklenebilirliğini doğrulamak için, efektör hücreler fenotipik ve fonksiyonel olarak daha fazla karakterize edildi. CD19 CAR-T hücreleri için CAR ifadesini niceleştirdik ve CD4+ ile CD8+ alt kümelerini değerlendirdik; CD19 CAR+ CD8+ T hücrelerinin baskınlığını not ettik (Şekil 3A-B, Ek Tablo 1). CIK hücreleri için, T (CD3+CD56-), NK (CD3-CD56+) ve CIK (CD3+CD56+) popülasyonlarının (Şekil 3D) sıklığını ve aktive edici reseptör NKG2D'nin ifadesini değerlendirdik (Şekil 3E, Ek Tablo 2). Ayrıca, hem CAR-T hem de CIK hücreleri için G-24 ve G-6M kültür formatları arasında genel olarak karşılaştırılabilir fenotipler ve spesifik popülasyon belirteçlerinin ifadesini gözlemledik. CD19 CAR-T ve CIK hücre ürünlerinin farklılaşma durumu, CD62L ve CD45RA boyama ile analiz edildi (Şekil 3C-F, Ek Tablo 1, Ek Tablo 2), G-24 ve G-6M formatlarında kültürlenen hücreler arasında benzer hafıza ve efektör fenotipleri ortaya çıktı. Bu bulgular, sürecin ölçeklendirilmesinin genişletilmiş efektör hücre popülasyonlarının fenotipik bütünlüğünü veya farklılaşma durumunu bozmadığını göstermektedir.
Son olarak, fonksiyonel potensisi değerlendirmek için hedefe özgü sitotoksisite testleri kullandık. Her iki cihazda da genişleyen CD19 CAR-T ve CIK hücreleri güçlü sitolitik aktivite sergilemiş ve ölçek genelinde fonksiyonel özelliklerin korunduğunu doğrulamıştır (Şekil 4). Genel olarak, bu sonuçlar genişletilmiş ürünlerin preklinik modellerde ve potansiyel olarak klinik testlerde sonraki uygulamalara uygunluğunu desteklemektedir.
<img alt="Şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Şekil 2: CD19 CAR-T ve CIK hücrelerinin çoğalması ve canlılığı. G-24 ve G-6M plakalarındaki PBMC'lerden genişletilen CAR-T hücreleri (n = 5) ve CIK hücreleri (n = 6), genişlemenin 9. ve 14. gününde sırasıyla toplanarak, hücre sayısı ve (A-C) kat artışı ile (B-D) yüzdesinin değerlendirilmesi için canlanabilir hücreler yapıldı. Histogramlar ortalama ifadeyi ± standart sapmayı (SD) temsil eder, noktalar ise tek bağışçıları gösterir (bireysel değerler için Ek Tablo 1 ve Ek Tablo 2'ye bakınız). Veriler, iki kuyruklu çoklu çift t-testi (A-C) veya birden fazla iki kuyruklu Wilcoxon eşleştirilmiş çift sıralama testi (B-D) ile analiz edildi; çoklu karşılaştırmalar için Holm-Sidak düzeltmesi yapıldı (*p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Şekil 3: G-24 ve G-6M cihazlarında genişletilen CD19 CAR-T ve CIK hücrelerinin fenotipinin değerlendirilmesi. CD19 CAR-T hücrelerindeki CAR moleküllerinin ifadesi (n = 5) akış sitometrisiyle analiz edilerek (A) G-24 ve G-6M genleşme protokollerindeki transdüksiyon verimliliği ile CD3+CAR+ alt kümesindeki (B) CD4+/CD8+ ve (C) naif/hafıza alt popülasyonlarının ekspresyonunu değerlendirdi. Toplu CIK hücrelerinin fenotipi (n = 6) akış sitometrisiyle analiz edilerek (D) CIK (CD3+CD56+), NK (CD3-CD56+) ve T (CD3+CD56-) yüzdesi, ayrıca (E) NKG2D ve (F) naiv/hafıza alt popülasyonu CD3+CD56+ alt kümesinde (G-24 n=5, G-6M n=6) incelendi. Naif (CD45RA+CD62L+), Merkezi Bellek (CM, CD45RA-CD62L+), Efektör Bellek (EM, CD45RA-CD62L-) ve Efektör Bellek CD45RA-pozitif (EMRA, CD45RA+CD62L-). Histogramlar SD ± ortalama ifadesini temsil ederken, noktalar tek bağışçıları gösterir (bireysel değerler için Ek Tablo 1 ve Ek Tablo 2'ye bakınız). Veriler, iki kuyruklu çoklu çift t-testi (B-C-D-F) veya iki kuyruklu Wilcoxon eşleştirilmiş rütbe testi (A-E) ile analiz edildi; çoklu karşılaştırmalar için Holm-Sidak düzeltmesi yapıldı (*p &lt; 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Şekil 4: CD19 CAR-T ve CIK hücre sitotoksisitesinin değerlendirilmesi. (A) CD19 CAR-T hücrelerinin (turuncu, n = 5) veya transdüksiyon edilmemiş (UTD) hücrelerinin (gri, n = 5) Burkitt lenfoma Raji hücre hattına karşı spesifik lizisi (süspansiyon hücre hattı modeli olarak) 6 saat akış sitometrisine dayalı öldürme testi ile gerçekleştirildi. Sonuçlar, SD ± ortalama spesifik lizis olarak gösterilmiştir. (B) Meme kanseri MCF-7 hücre hattı (yapışkan hücre hattı modeli olarak) karşı G-24 (açık mavi, n = 7) veya G-6M (koyu mavi, n=6) içinde kültürlenen CIK hücrelerinin sitotoksisitesi (yapışkan hücre hattı modeli olarak) her 15 dakikada bir 24 saat boyunca gerçek zamanlı hücre analizörü kullanılarak izlenmiştir. Sonuçlar, SEM ± ortalama spesifik liz olarak gösterilmiştir. Veriler, Mann-Whitney testi, Holm-Sidak düzeltmesi ile çoklu karşılaştırmalar için analiz edilmiştir (*p &lt; 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: Akış sitometrisi analizleri için kullanılan geçiş stratejisi. (A) CAR-T hücresi ve (B) CIK hücre fenotipik karakterizasyonu ile (C) floresan hücre boyası bazlı sitotoksisite testi için kapı stratejilerini gösteren temsilci grafikler. Bu <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_Figure%201_RE.pdf" target="_blank">dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 1: Bireysel bağışçılardan alınan CD19 CAR-T hücre kültürlerinin büyümesi, yaşamlılığı ve fenotipi. Her donör için G-24 ve G-6M cihazlarında kültürün 9. gününde alınan CD19-CAR T hücrelerinin toplam hücre sayısı, katlama artışı, canlılığı ve fenotipik karakterizasyonu gösterilmiştir. Bu <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_1_RE.xlsx" target="_blank">dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 2: Bireysel bağışçılardan alınan CIK hücre kültürlerinin büyümesi, canlılığı ve fenotipi. Her donör için G-24 ve G-6M cihazlarında kültürün 14. gününde elde edilen CIK hücrelerinin toplam hücre sayısı, katlanma artışı, canlılığı ve fenotipik karakterizasyonu gösterilmiştir. Bu <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_2_RE.xlsx" target="_blank">dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

GMP ölçeklenebilir cihazlarda CAR-T ve sitokin kaynaklı katil hücrelerin verimli ve hızlı üretimi

Adoptive cell therapies (ACT) have progressed rapidly in recent years, playing a pivotal role in cancer immunotherapy and significantly influencing ...

efficient-rapid-generation-car-t-cytokine-induced-killer-cells-gmp

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Üretimi için hızlı, basit ve maliyet-etkin bir protokol, CMV, İlan EBV enfeksiyonları yakalanma riski altında allojeneik hematopoietik kök hücre nakli (HSCT) alıcıları infüzyon için donör kaynaklı multivirus spesifik CTL (rCTL). Bu üretim sürecine GMP uyumlu ve T-hücre immünoterapi uzmanlaşmış merkezlerde ötesinde daha geniş bir şekilde uygulanmasını sağlamak olmalıdır.

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Kemoterapi ve radyasyon bakım standardının lenfodepletiktif ve immünomodülatör etkileri, T hücresi immünoterapisinin antitümör etkinliğini artırmak için kullanılabilir. EGFRvIII'e özgü kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücrelerinin üretilmesi ve bunların glioblastoma bakım standardı bağlamında uygulanması için bir yöntemin ana hatlarını çiziyoruz.

Bakım Glioblastoma Standardı Kapsamında Adoptif Tedavisi için CAR T hücrelerinin üretilmesi

Bu protokolün amacı, kapalı bir sitokin yakalama sistemi içeren ve özel personel veya bir GMP tesisinin kullanılmasını gerektirmeyen tezgah üstü, otomatik, ikinci nesil hücre zenginleştirme cihazı kullanarak patojene özgü klinik dereceli T hücreleri üretmektir. Üretilen sitomegalovirüs pp65'e özgü T hücreleri doğrudan hastalara uygulanabilir.

Sitokin yakalama Sistemi kullanılarak Klinik Uygulamalar için Sitomegalovirüs özgü otomatik Hücre Zenginleştirme T hücreleri

Burada, bir CRISPR/Cas9 sistemi üzerinden araç-T hücrelerini genetik olarak düzenlemek için bir protokol sunuyoruz.

CAR-T hücrelerinde GM-CSF ' ı Knock Out için CRISPR/Cas9 kullanma

Bu makalede, in vitro ve in vivo kullanılmak üzere fonksiyonel T hücrelerinin yüksek sayıda verim amacı ile, antijene özgü CD8 T hücrelerinin üretimi ve bunların in vitro genişlemesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Otoimmün Diyabet Modelinde Fonksiyonel Testler için Antijene Özgü Primer Fare Sitotoksik T Hücrelerinin Yüksek Verimli Üretimi

Sunulan Gama-Delta (φδ) T hücreli ilaç ürününün genişletilmesi için bir protokoldür. Lenfositler elütriasyon ile izole edilir ve zoledronik asit ve interlökin-2 ile zenginleştirilir. Alfa-beta T hücreleri klinik sınıf manyetik ayırma cihazı kullanılarak tükeniyor. δδ hücreleri K562 türevi, yapay antijen sunan hücrelerle birlikte kültürlenir ve genişletilir.

Aferezli İnsan Ürününden Gama-Delta (φδ) T Hücrelerinin Genişlemesi ve Zenginleştirilmesi

Bu protokol, İyi Üretim Uygulamaları (GMP) standartlarıyla uyumluluğu sağlayarak, ilgilenilen bir gen ile birincil insan T hücrelerinin dönüştürülmesi sürecini ana hatlarıyla belirtir.

Geni Değiştirilmiş T hücrelerinin Üretimi için GMP Uyumlu Bir Prosedür

Bu makale, klinik kullanım için kimerik antijen reseptörü T hücreleri için, özellikle viral transdüksiyon ve T hücrelerinin kültivasyonunu gerçekleştirebilen otomatik bir hücre işlemcisi kullanarak üretim sürecini detaylandırmaktadır. Erken aşama bir klinik araştırmanın süreç geliştirme ve uygulaması sırasında göz önünde bulundurulması gereken önerilerde bulunuyor ve tuzakları açıklıyoruz.

Otomatik Hücre İşlemcisinde Kimerik Antijen Reseptörü T Hücresi Üretimi

Bu protokol, retroviral vektör üretimini ve murin T hücresi transdüksiyonunu kolaylaştırarak fare CAR-T hücrelerinin verimli bir şekilde üretilmesini kolaylaştırır.

Murin kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin verimli üretimi

Burada, tek hücre düzeyinde hücre öldürmeyi incelemek için bir T hücresini ve bir kanser hedef hücresini kapsülleyen çift emülsiyon damlacıkları oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük bir T hücresi popülasyonu içinde hem sitotoksik moleküllerin hem de hedef hücre apoptozunun ikili miktar tayinine izin verir.

Kimerik Antijen Reseptörü T hücrelerini Tek Hücre Düzeyinde Değerlendirmek için Damlacık Bazlı Sitotoksisite Testi

Homoloji aracılı uç birleştirme (HMEJ) DNA onarım yolu yoluyla birincil insan T hücrelerinde büyük, multisistronik yapıların yüksek verimli hedefli knock-in'ini elde etmek için CRISPR / Cas9 teknolojisini kullanmak için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu cGMP'ye uyarlanabilir protokolle tasarlanan T hücreleri, mükemmel hücre genişlemesi, sitotoksisite ve sitokin üretimini korur.

Büyük DNA Şablonlarının Homoloji Aracılı Uç Birleştirme Hedefli Entegrasyonu Yoluyla Birincil İnsan T Hücrelerinin Viral Olmayan Mühendisliği

Öğrenin, G-Rex cihazlarında CAR-T ve CIK hücrelerinin GMP ölçeklenebilir üretim yöntemini. Bu protokol, yüksek yoğunluklu kültürlerde minimal kullanıcı müdahalesiyle klinik uygulama için hücre terapisi ürünlerinin verimli genişlemesini sağlar.

GMP ölçeklenebilir cihazlarda CAR-T ve sitokin kaynaklı katil hücrelerin verimli ve hızlı üretimi

Daha fazla video keşfet