Name: In vitro Bakteriyel Ubiquitinasyonun Yeniden Yapılandırılması ve VCP/p97 aracılı Eliminasyonun Yeniden Yapılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-02T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Öğrenin Streptococcus pneumoniae'nin ubiquitinasyonunu ve VCP/p97 kompleksinin bakteriyolitik aktivitesini. Bu yöntem, patojen savunmasında sitozolik koruyucu rolünü ve immün yanıt mekanizmalarını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unravelling+of+the+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The unravelling of the ubiquitin system.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (5), 322-324 (2015).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis%3A+from+the+lysosome+to+ubiquitin+and+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis: from the lysosome to ubiquitin and the proteasome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (1), 79-87 (2005).</li>
<li>Damgaard, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%3A+from+cell+signalling+to+disease+biology+and+new+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system: from cell signalling to disease biology and new therapeutic opportunities.</a> Cell Death Differ. 28 (2), 423-426 (2021).</li>
<li>Deol, K. K., Lorenz, S., Strieter, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+logic+of+ubiquitin+chain+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic logic of ubiquitin chain assembly.</a> Front Physiol. 10, 835(2019).</li>
<li>Kikkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+HRD1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+involved+in+degradation+of+proteins+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human HRD1 is an E3 ubiquitin ligase involved in degradation of proteins from the endoplasmic reticulum.</a> J Biol Chem. 279 (5), 3525-3534 (2004).</li>
<li>Korac, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-independent+function+of+optineurin+in+autophagic+clearance+of+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-independent function of optineurin in autophagic clearance of protein aggregates.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 2), 580-592 (2013).</li>
<li>Asmat, T. M., Agarwal, V., Saleh, M., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+Streptococcus+pneumoniae+via+the+polymeric+immunoglobulin+receptor+of+epithelial+cells+relies+on+clathrin-+and+caveolin-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of Streptococcus pneumoniae via the polymeric immunoglobulin receptor of epithelial cells relies on clathrin- and caveolin-dependent mechanisms.</a> Int J Med Microbiol. 304 (8), 1233-1246 (2014).</li>
<li>Ercoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+replication+of+Streptococcus+pneumoniae+inside+splenic+macrophages+serves+as+a+reservoir+for+septicaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular replication of Streptococcus pneumoniae inside splenic macrophages serves as a reservoir for septicaemia.</a> Nat Microbiol. 3 (5), 600-610 (2018).</li>
<li>Chakravortty, D., Rohde, M., Jäger, L., Deiwick, J., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+novel+surface+structure+encoded+by+Salmonella+pathogenicity+island+2%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Formation of a novel surface structure encoded by Salmonella pathogenicity island 2.</a> EMBO J. 24 (11), 2043-2052 (2005).</li>
<li>Surve, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+pneumolysin+expression+governs+the+fate+of+Streptococcus+pneumoniae+during+blood-brain+barrier+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in pneumolysin expression governs the fate of Streptococcus pneumoniae during blood-brain barrier trafficking.</a> PLoS Pathog. 14 (7), e1007168(2018).</li>
<li>Franco, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+SMURF1+functions+in+selective+autophagy+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+anti-tuberculous+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase SMURF1 functions in selective autophagy of Mycobacterium tuberculosis and anti-tuberculous host defense.</a> Cell Host Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).</li>
<li>Manzanillo, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+Parkin+mediates+resistance+to+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase Parkin mediates resistance to intracellular pathogens.</a> Nature. 501 (7468), 512-516 (2013).</li>
<li>Polajnar, M., Dietz, M. S., Heilemann, M., Behrends, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+host+cell+ubiquitylation+machinery+targeting+cytosolic+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Expanding the host cell ubiquitylation machinery targeting cytosolic Salmonella.</a> EMBO Rep. 18 (9), 1572-1585 (2017).</li>
<li>Huett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+LRR+and+RING+domain+protein+LRSAM1+is+an+E3+ligase+crucial+for+ubiquitin-dependent+autophagy+of+intracellular+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The LRR and RING domain protein LRSAM1 is an E3 ligase crucial for ubiquitin-dependent autophagy of intracellular Salmonella typhimurium.</a> Cell Host Microbe. 12 (6), 778-790 (2012).</li>
<li>Otten, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitylation+of+lipopolysaccharide+by+RNF213+during+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ubiquitylation of lipopolysaccharide by RNF213 during bacterial infection.</a> Nature. 594 (7861), 111-116 (2021).</li>
<li>Yamada, A., Hikichi, M., Nozawa, T., Nakagawa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FBXO2%2FSCF+ubiquitin+ligase+complex+directs+xenophagy+through+recognizing+bacterial+surface+glycan%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">FBXO2/SCF ubiquitin ligase complex directs xenophagy through recognizing bacterial surface glycan.</a> EMBO Rep. 22 (11), e52584(2021).</li>
<li>Apte, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+innate+pathogen+sensing+strategy+involving+ubiquitination+of+bacterial+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">An innate pathogen sensing strategy involving ubiquitination of bacterial surface proteins.</a> Sci Adv. 9 (12), eade1851(2023).</li>
<li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+AAA-ATPase+VCP%2Fp97+lyses+ubiquitinated+intracellular+bacteria+as+an+innate+antimicrobial+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Host AAA-ATPase VCP/p97 lyses ubiquitinated intracellular bacteria as an innate antimicrobial defence.</a> Nat Microbiol. , (2025).</li>
<li>Mitchell, G., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+to+intracellular+pathogens%3A+balancing+microbial+elimination+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Innate immunity to intracellular pathogens: balancing microbial elimination and inflammation.</a> Cell Host Microbe. 22 (2), 166-175 (2017).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J Mol Biol. 166 (4), 557-580 (1983).</li>
<li>Blythe, E. E., Olson, K. C., Chau, V., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-+and+ATP-dependent+unfoldase+activity+of+p97%2FVCP-NPLoc4-UFD1L+is+enhanced+by+a+mutation+that+causes+multisystem+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin- and ATP-dependent unfoldase activity of p97/VCP-NPLoc4-UFD1L is enhanced by a mutation that causes multisystem proteinopathy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (22), E4380-E4388 (2017).</li>
<li>Ducker, C., Ratnam, M., Shaw, P. E., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+protein+expression+systems+and+PTM+landscape+in+the+study+of+transcription+factor+ELK-1%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of protein expression systems and PTM landscape in the study of transcription factor ELK-1.</a> Protein Expr Purif. 203, 106216(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>50X Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Promega&nbsp;</td><td>G6521</td><td></td></tr><tr><td>6x-His-Ubiquitin</td><td>UBPBio</td><td>E1100</td><td></td></tr><tr><td>A549 hücre hattı&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ubiquitin antikor</td><td>Enzo</td><td>BML-PW8810-0100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ubiquitin K48-Specific, klon Apu2 antikoru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ZRB2150</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/sigma/a6419">A6419</a></td><td></td></tr><tr><td>BHI</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>M210</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (yüksek glikoz)</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>AL251</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco (ABD kökenli)</td><td>38220090</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>PureSynth&nbsp;</td><td>PSR37325</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TC006</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6148</td><td></td></tr><tr><td>pET28a-p97 plazmid</td><td>Laboratuvarımız</td><td></td><td>Plazmid talep üzerine temin edilebilir</td></tr><tr><td>pET41b-NPLOC4 plazmid</td><td>Laboratuvarımız</td><td></td><td>Plazmid talep üzerine temin edilebilir</td></tr><tr><td>pET41b-UFD1 plazmid</td><td>Addgene</td><td>Plazmid #117107</td><td></td></tr><tr><td>Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23-030</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus pneumoniae R6 sızıltı</td><td>ATCC</td><td>ATCC BAA-255</td><td>Risk Grubu -2 patojeni, BSL-2 tesisinde ele alınacak</td></tr><tr><td>Todd Hewitt et suyu tozu</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>M313</td><td></td></tr><tr><td>UBE1</td><td>UBPBio</td><td>B1100</td><td></td></tr><tr><td>UbE2C</td><td>UBPBio</td><td>C1300</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>MB032</td><td></td></tr><tr><td>Maya özlü toz ve nbsp;</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>RM027</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro bakteriyel ubiquitinasyonun yeniden yapılandırılması ve vcp/p97 aracılı eliminasyonun yeniden yapılması

In-vitro Reconstitution of Bacterial Ubiquitination and VCP/p97-mediated Elimination

Protokolümüz, memeli A549 hücrelerinin ubiquitinasyon sürecini başlatmak için gerekli bileşenler açısından zengin bir hücre lizat üretmek amacıyla kullanımını detaylandırmaktadır (Şekil 1A). Bu lizat, ister yoğunlaştırılmış durumda olsun ister UBE1 (E1 ubiquitin aktive edici enzim), UbE2C (E2 ubiquitin konjuge enzim) ve Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 kompleksi (E3 ubiquitin ligaz) gibi saflaştırılmış bileşenlerle değiştirilerek bakterilerin in vitro ubiquitina...

In vitro Bakteriyel Ubiquitinasyonun Yeniden Yapılandırılması ve VCP/p97 aracılı Eliminasyonun Yeniden Yapılması

Ubiquitination is a versatile post-translational modification that plays a critical role in cytosolic immunity. Upon invasion of the host cells, ...

in-vitro-reconstitution-bacterial-ubiquitination-vcpp97-mediated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada açıklanan nerede eksojen antijenleri endoplazmik retikulum ilişkili düşmesine çapraz-sunum tarafından işlenen hücresel kompartmanlarda arıtma için izin verir yeni bir vezikül yalıtım Protokolü yöntemidir.

Membran yuvası arıtma için çapraz-sunudaki eksojen antijenleri endoplazmik retikulum ilişkili bozulma

Ubikuitin ligazlar, birkaç E3 SUMO ligazlar tespit edilmiştir. Bu değiştirilmiş vitro SUMOylation Protokolü roman SUMO E3 ligazlar bir vitro sulandırma tahlil tarafından tespit edebilmek.

Vitro SUMOylation SUMO E3 ligaz etkinlik eğitim için tahlil

Ubiquitination hücresel süreçlerde önemli roller oynar ve sıkıca deubiquitination tarafından koordine edilen bir post-translational modifikasyon olduğunu. Her iki reaksiyon kusurları insan patolojileri altında yatan. Biz arıtılmış bileşenleri kullanarak in vitro mayası ve deubiquitination reaksiyonu yürütmek için protokoller sunuyoruz.

Nükliosomal Histones in vitro Ubiquitination ve Deubiquitination bulguları

Bu çalışma, bir pomalidomür bazlı sentez ve karakterizasyon açıklar, yeni bir yaklaşım olarak bir roman yaklaşımı ve E3 Ubiquitin ligaz cereblon (CRBN), thalidomür analogların hedefi bozulması teşvik etmek.

Pomalidomür tabanlı homo-PROTACs tarafından E3 Ubiquitin ligase Cereblon kimyasal Inaktivasyonu

Bu protokol, bu tür çeviri sonrası modifikasyonların (PtM'ler) bir tedavi veya fenotip gibi belirli bir durumla ilişkili değişikliklerini belirlemek için ubiquitin (Ub) ve ubiquitin benzeri (Ubls) spesifik proteomların oluşturulmasını amaçlamaktadır.

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Bu yöntem, ubiquitin zincir topolojislerindeki küresel değişikliklerin değerlendirilmesini açıklar. Değerlendirme, kütle spektrometresi tabanlı hedefli proteomik yaklaşımın uygulanmasıyla gerçekleştirilir.

Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

Bu çalışma, E3 ubiquitin ligase katalitik aktivitesinin analizi için ayrıntılı in vitro ubiquitylation tahlil protokolleri sunmaktadır. Rekombinant proteinler Escherichia coli kültürü gibi prokaryotik sistemler kullanılarak ifade edildi.

In Vitro E3 Ubiquitin Ligase fonksiyonunun analizi

Her yerde, disrrengülasyonu çok sayıda insan hastalığına karışmış kritik bir protein post-translational modifikasyondur. Bu protokol, faj ekranının, her yerde bulunmanın özgüllüğünü, verimliliğini ve kalıplarını kontrol eden E3 ligaslarının aktivitesini bağlayabilen ve modüle edebilen yeni ubiquitin varyantlarını izole etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

E3 Ligases için Ubiquitin Varyant Modülatörleri Geliştirmek için Faj Ekran Kullanma

Memeli hücrelerinde belirli bir substratın ubikitilasyon testi ve bir E3 ubikitin-ligazının ubikitilasyon testi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. HEK293T hücre hatları protein aşırı ekspresyonu için kullanıldı, poliubikitillenmiş substrat immünopresipitasyon ile hücre lizatlarından arındırıldı ve SDS-PAGE'de çözüldü. Bu post-translasyonel modifikasyonu görselleştirmek için immünoblotlama kullanıldı.

Memeli Hücre Lisatlarında E3 Ubikitin-ligaz ile Substrat Ubikitilasyonunun Değerlendirilmesi

Protokol, örnek olarak p53 tümör baskılayıcı proteini kullanarak memeli hücrelerinden ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için adım adım bir yöntemi açıklar. Ubikitinlenmiş p53 proteinleri, sıkı denatüre olmayan ve denatüre edici koşullar altında hücrelerden saflaştırıldı.

Memeli Hücrelerinden Ubikitinlenmiş p53 Proteinlerinin Saflaştırılması

Bu protokol, rekombinant protein saflaştırmasını ubikitin zincir bölünme deneyleri ile birleştirerek nörogelişimsel bozukluklarla ilişkili genetik varyasyonun deubikitile edici enzim aktivitesi üzerindeki etkisinin nasıl ölçüleceğini açıklar.

Nörogelişimsel Bozuklukla İlişkili Deubikitile Edici Enzimlerin İn Vitro Ubikitin Zincir Bölünme Testi ile Enzimatik Aktivitesinin Ölçülmesi

Öğrenin Streptococcus pneumoniae'nin ubiquitinasyonunu ve VCP/p97 kompleksinin bakteriyolitik aktivitesini. Bu yöntem, patojen savunmasında sitozolik koruyucu rolünü ve immün yanıt mekanizmalarını incelemek için kullanılır.

In vitro Bakteriyel Ubiquitinasyonun Yeniden Yapılandırılması ve VCP/p97 aracılı Eliminasyonun Yeniden Yapılması

Daha fazla video keşfet