In vitro Bakteriyel Ubiquitinasyonun Yeniden Yapılandırılması ve VCP/p97 aracılı Eliminasyonun Yeniden Yapılması

Çalışmamız, VCP veya p97'nin birden fazla farklı patojene karşı nasıl bir sitozolik koruyucu olarak görev yaptığını ortaya koyuyor. Bu, VCP veya p97'nin terapötik uygulamalar ve biyomühendislik stratejileri için potansiyelini ortaya çıkarır. Rutin biyokimyaya ek olarak, süper çözünürlüklü mikroskopi, kriyo EM, kriyo ET kullanılarak bu konak etkileyicilerin patojenler üzerinde nasıl organize edilip onları yok ettiğini tespit edilir.

Başlamak için, streptococcus pnömonisi, 37 derece Celsius'ta gece boyunca %5 karbondioksit ile Todd Hewitt maya ortamında altı suşlu serotip iki yetiştirmektir. Gece kültürünün bir kısmını taze Todd Hewitt maya ortamının 10 parçasına aşılayın ve %5 karbondioksit ile 37 derece Celsius'ta inkübe yapın, optik yoğunluk 600 nanometrede 0,4'e ulaşana kadar. Sonra 900 mikrolitre streptococcus pnömoni kültürünü, 600 mikrolitre %50 gliserol ile karıştırın ve gliserol stokunu eksi 80 derece Celsius'ta saklayın.

Sonra -80 derece Celsius'tan yeni bir streptococcus pnömoni stokunu eritin ve tamamen beş mililitre Todd Hewitt maya ortamına aşılayın. Yedi streptococcus pnömoni hücresinin yaklaşık 10 gücüne ulaşın. Hücreleri iyice yıkamak için, bakterileri reaksiyon tamponunda tekrar askıya alın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 21.000 G'de santrifüj yapın.

Pelleti 549 memeli hücre lizatıyla yeniden askıya alın. Sonra saflaştırılmış ubiquitin ve bir millimolar adenozin trifosfat ekleyip karışımı 27 derece Celsius'ta bir ila iki saat kuluçka edin. Sonra bakterileri bir kez bir azı dadı içeren bir tampon içeren reaksiyon tamponu ile yıkayın, ardından sadece reaksiyon tamponu ile iki ek yıkama yapılır.

Bakteriyi %1 paraformaldehit ile düzeltin. Fiksasyondan sonra, hücreleri 15 dakika boyunca mililitrede bir miligram glisin içeren PBS ile inkübe edin. Sonra PBS ile iki kez yıkayın.

Reaksiyon tamponu içinde ubiquitin ile diğer gerekli bileşenleri birleştirerek bir reaksiyon karışımı hazırlayın. Reaksiyon karışımının toplam hacmini 100 ila 150 mikrolitre ayarlayın. Reaksiyon karışımı içeren ubiquitin enzimindeki bakterileri yeniden askıya alın ve süspansiyonu 27 derece Celsius'ta iki saat kuluçka altına alın.

Bakterileri üre içeren reaksiyon tamponu ile üç kez yıkandıktan sonra, %1 paraformaldehit ile sabitlenin. Fiksasyondan sonra, hücreleri 15 dakika boyunca mililitrede bir miligram glisin içeren PBS ile inkübe edin. Sonra örneği %3 BSA'da 27 derece Celsius sıcaklığında bir saat boyunca kuluçka yapın ve örneği PBS ile iki kez yıkayın.

Ubiquitinated bakterileri, immünoflüoresans testlerinde genellikle kullanılan konsantrasyonlardan daha yüksek konsantrasyonlarda hazırlanan primer antikor çözeltisinde yeniden askıya alın. Sonra 27 derece Celsius'ta bir saat kuluçka yapın. Bakterileri PBS ile iki kez yıkandıktan sonra, Alexa Fluor 488 ve Alexa Fluor 555 ile konjuge edilmiş ilgili ikincil antikorda tekrar askıya alın.

Şimdi etiketlenmiş bakteri örneğini yaklaşık 10 ila 20 mikrolitre cam slayta dökün ve DAPI ile veya olmadan 5 ila 10 mikrolitre montaj ortamı karıştırın. Numunenin üzerine bir kapak kuşağı yerleştirin ve fazla sıvıyı silmek için mendil kağıdı kullanın. Altı mikromolar VCP p97, bir mikromolar NPLOC4 ve bir mikromolar UFD-1 ile birleştirin.

Reaksiyon karışımının hacmini yaklaşık 90 mikrolitre ayarlayın, reaksiyon tamponu kullanarak ve iki saat boyunca buz üzerinde kuluçka yapın. Sonra, p97 UFD-1, NPLOC4 içeren reaksiyon karışımına bir ila iki millimolar adenozin trifosfat ekleyin. Sonra bunu yedi ubiquitinated streptococcus pnömoni hücresi gücünde 10 ile birleştirin ve 37 derece Celsius'ta iki saat kuluçka yapın.

Tedaviden hemen sonra, reaksiyon karışımından 10 mikrolitre aliquot alın ve seri seyreltme uygulanır. Her seyreltmeden 10 ila 20 mikrolitre kadarını beyin kalp infüzyon auger plakalarına yerleştirin. Sıfır saat ile iki saatlik zaman noktaları arasında koloni oluşum birimlerini değerlendirin.

Bakteriyel canlılık yüzdesi, iki saatlik CFU sayısını sıfır saatlik CFU sayısına bölerek ve 100 ile çarparak hesaplayın. Streptococcus pneumoniae'nin önemli ubiquitinasyonu, memeli hücre lizat veya yeniden oluşturulmuş E-1, E-2, E-3 enzim sistemi ile tedavi edildiğinde gözlemlenmiştir. Ubiquitinasyon sinyali kontrol sisteminde yoktu ve ubiquitinated streptococcus pneumoniae OTUB1'e maruz kaldığında belirgin şekilde azaldı; bu da K48 bağlantılı poli ubiquitin modifikasyonunu doğruladı.

Bir çizgi profil analizi, ubiquitin ve bakteri sinyalleri arasında tam örtüşme göstererek onların mekânsal ortak lokalizasyonlarını doğruladı. Üç boyutlu rekonstrüksiyon, ubiquitin ve streptococcus pneumoniae sinyallerinin mekansal örtüşmesini doğruladı. Vahşi tip p97, kofaktorları UFD1 ve NPLOC4 ile birleştiğinde, ubiquitinasyonun hücre lizat ile mi yoksa saflaştırılmış enzim sistemi ile yapılmasına bakılmaksızın, bakteriyel canlılığı iki saat içinde %10 ila %20'ye düşürdü.

Ubiquitinasyon atıldığında, p97 ısıyla inaktive edildiğinde veya katalizleyici olarak inaktif p97, E57 8Q mutantı kullanıldığında bakteriyel canlılıkta herhangi bir azalma gözlemlenmedi; bu da hem ubiquitinasyonun hem de aktif p97'nin bakteri öldürme için gerekli olduğunu doğruladı. Çalışmamız, ev sahibi E3 ubiquitin ligazlarının farklı patojenleri nasıl değiştirdiğini ve enfeksîyoncu tehditleri ortadan kaldırmak için etkitör mekanizmalarını araştırdığını ortaya koymaktadır. Sonra, p97 veya VCP'nin nasıl düzenlendiğini keşfetmeyi ve antibakteriyel aktivitesini artırmak için daha da mühendislik yapmayı hedefledik.