Biyomarker Keşfinde Hedeflenmemiş Gözyaşı Sıvısı Lipidomikleri için Fenol Kırmızı İplik Tabanlı Örnekleme Prosedürü

Gelecekteki gözyaşı biyobelirteç keşfi için tekrarlanabilir gözyaşı lipidomik profilleri elde etmeye yardımcı olmak amacıyla daha standartlaştırılmış, kullanımı kolay fenol kırmızı iplik tabanlı bir yöntem oluşturduk. Mevcut zorluk, Schirmer şeritlerinin tahriş etmesi, ancak kılıfların gözyaşı toplamada operatör değişkenlikleri göstermesidir. Bu durum, deneysel raporlanabilirliği ve çalışmalar arası karşılaştırmaları engeller.

Başlamak için, eldiven takın ve çalışma istasyonunu dikkatlice dezenfekte ederek numunenin herhangi bir kirlenmesini önleyin. Fenol kırmızı ipliği bükülen kancanın karşısındaki ucundan tutun, bükülmüş kanca bölgesine dokunmamaya dikkat edin. Deneğe bakışlarını üst burun yönüne çevirmesini iste.

Sonra deneğin alt göz kapağını nazikçe aşağı çekin ve fenol kırmızı ipliği bükülmüş kancalı gözün dış köşesine yakın alt temporal palpebral konjonktivaya yerleştirin. Şimdi, denek gözlerini nazikçe kapatmasını ve fenol kırmızı ipliğin yüz derisine temas etmemesi için başını hafifçe öne eğmesini iste. Deneğin alt göz kapağını tekrar aşağı çekin ve fenol kırmızı ipliği nazikçe çıkarın, örneklenen bölgeyle temas etmeyin.

Örneklenen kırmızı bölgenin uzunluğunu kaydedin. Steril forseps kullanarak PRT'yi yeni bir örnek tüpüne aktarın. Şimdi örnek tüpünü düzgün şekilde etiketleyip kapapan.

Örneklenen uzunluk 50 milimetreden azsa, deneğe bir ila üç dakika dinlenmesini söyleyin ve ardından aynı gözle gözyaşı sıvısı toplamayı tekrarlayın. Her yeni örneklenen PRT'yi ayrı bir örnek tüpüne yerleştirin. Metanol ve temiz kağıt mendil kullanarak, eldivenleri ve pensleri dikkatlice temizleyerek gözyaşı kalıntılarını veya kirleticileri yok edin.

Sonra tamamen hava ile kurumasına izin verin. Tüm örnek tüplerini parafilm ile mühürleyin ve geçici depolama için hemen -20 derece Celsius'ta veya uzun süreli depolama için -80 derece Celsius'ta saklayın. Mikro makas ve pensleri fenol kırmızı iplikleri işlemeden önce metanol ile önceden yıkayın.

Her fenol kırmızı iplikten yaklaşık ilk üç milimetre kadar bükülmüş kanca ucunu kesin. Örneklenen bölgeyi fenol kırmızısı boya önüne kadar iki milimetrelik parçalara ayırın ve bu segmentleri temiz 1,5 mililitrelik organik çözücü toleranslı mikrosantrifüj tüpü ile toplayın. Eğik kanca ucunu ve istenmeyen PRT bölgesini at.

Numuneleri çıkarmadan önce düşük sıcaklıkta tutmak için buzun üzerine koyun. Şimdi, her numuneye 232 mikrolitre buz soğukluğu kütle spektrometrisi kalitesinde metanol ekleyin ve 15 saniye boyunca girdabı ekleyin ve iyice karıştırın. Örnekleri önceden soğuttulan ultrasonik temizleyicide 15 dakika sonikle geçirin.

Sonra her numuneye 774 mikrolitre HPLC kalitesinde metil tert-bütil eter ve 194 mikrolitre deiyonize su eklenin. Çözücüleri iyice karıştırmak için tekrar 15 saniye vortex yapın. Örnekleri önceden soğutulmuş ultrasonik temizleyicide tekrar 15 dakika daha soniklendirin.

Sonikasyon sonrası, örnekleri dört derece Celsius derecesine ayarlanmış bir TermoMikserde sekiz saat boyunca dakikada 1.200 devirde sallayarak kuluçka edin. Sonra karışımı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden bekletin. Karışımları 10.000 G'de 10 dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüjlendirin.

Santrifüjlemeden sonra, karışımların iki farklı sıvı faza ayırıldığından emin olun. Lipid içeren üst organik fazdan 700 mikrolitre dikkatlice toplayın ve önceden soğutulan, yeni 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Alt sulu faz, tehlikeli kimyasal atık olarak metil tert-bütil eter ve metanol içeren atılır.

Lipid özlerini, dört saat boyunca dört derece Celsius sıcaklığında ayarlanmış buzdolabında SpeedVac konsantratör ile kurutun. Kurutulmuş lipid özleri kısa süreli depolama için eksi 20 derece Celsius'ta veya uzun süreli depolama için eksi 80 derece Celsius'ta saklanır. Metanol-kloroform çözücü karışımını metanol ile kloroformu bire bir hacim oranında karıştırarak hazırlayın.

Kurutulmuş lipid özlerini, buz gibi soğukkanlı metanol-kloroform çözücü karışımından 50 mikrolitre kullanarak yeniden yapılandırın. Yeniden oluşturulan çözeltiyi önceden soğutulmuş ultrasonik temizleyicide 15 dakika sonikle geçirin. Şimdi, yeniden oluşturulmuş lipid ekstraktlarını 14.000 G ve dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüj edin.

Ortaya çıkan süpernatantın 40 mikrolitresini dikkatlice cam bir iç ile donatılmış bir otomatik numune alan cam şişeye aktarın. Şişe, sıvı kromatografi tandem kütle spektrometrisi analizine hazırlanmak için yarıksız septum açık bir kapakla sıkıca kapatın. Katı kriterler kullanılarak, sırasıyla birinci, iki çoğaltma ve üç örnek grupta 773, 890 ve 1.025 benzersiz lipid türü tanımlandı.

Pozitif iyon modu ise %26 derece A, %13,2 derece B ve %60,8 derece C tanımladığı 1.302 lipid türü tespit etti. Negatif iyon modu, yaklaşık %8,2 A, %22,9 B ve %68,9 C derecesi tanımlamış 257 lipid türü tespit etti. Depolama ile ilgili varyasyonlara rağmen, üç örnek setinde tutarlı şekilde 394 benzersiz lipid türü tespit edilmiştir.

Üç ziyarette denek arası varyasyon katsayısı pozitif modda %21,5, negatif modda %31,3 idi. Bu protokol, tekrarlanabilir gözyaşı lipidomik analizi için standart bir iş akışının eksikliğini ele alır ve çalışmalar arası karşılaştırılabilirliği artırabilir. PRT tabanlı yöntemimiz tahrişi en aza indirir, hızlı gözyaşı toplama sağlar ve operatör değişkenliğini azaltır.

Gelecekteki araştırmalarımız, büyük gruplarda gözyaşı lipidomik biyobelirteçlerini doğrulayacak ve kişiselleştirilmiş tanılar için multiomikleri entegre edecektir.