Biyomarker Keşfinde Hedeflenmemiş Gözyaşı Sıvısı Lipidomikleri için Fenol Kırmızı İplik Tabanlı Örnekleme Prosedürü
December 12th, 2025
Bu protokol, fenol kırmızı iplikler ve sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) tabanlı iş akışı kullanılarak insan gözyaşı sıvısı örnekleri toplamak için benzersiz bir klinik protokolü açıklar; böylece gözyaşı lipidomik profili keşfedilir. Basit metil tert-bütil eter (MTBE)/metanol bifazlı ayırma yöntemi, gözyaşı biyobelirteç keşfi için yüksek geri kazanımla hızlı gözyaşı lipid çıkarımı sağlar.
Gelecekteki gözyaşı biyobelirteç keşfi için tekrarlanabilir gözyaşı lipidomik profilleri elde etmeye yardımcı olmak amacıyla daha standartlaştırılmış, kullanımı kolay fenol kırmızı iplik tabanlı bir yöntem oluşturduk. Mevcut zorluk, Schirmer şeritlerinin tahriş etmesi, ancak kılıfların gözyaşı toplamada operatör değişkenlikleri göstermesidir. Bu durum, deneysel raporlanabilirliği ve çalışmalar arası karşılaştırmaları engeller.
Başlamak için, eldiven takın ve çalışma istasyonunu dikkatlice dezenfekte ederek numunenin herhangi bir kirlenmesini önleyin. Fenol kırmızı ipliği bükülen kancanın karşısındaki ucundan tutun, bükülmüş kanca bölgesine dokunmamaya dikkat edin. Deneğe bakışlarını üst burun yönüne çevirmesini iste.
Sonra deneğin alt göz kapağını nazikçe aşağı çekin ve fenol kırmızı ipliği bükülmüş kancalı gözün dış köşesine yakın alt temporal palpebral konjonktivaya yerleştirin. Şimdi, denek gözlerini nazikçe kapatmasını ve fenol kırmızı ipliğin yüz derisine temas etmemesi için başını hafifçe öne eğmesini iste. Deneğin alt göz kapağını tekrar aşağı çekin ve fenol kırmızı ipliği nazikçe çıkarın, örneklenen bölgeyle temas etmeyin.
Örneklenen kırmızı bölgenin uzunluğunu kaydedin. Steril forseps kullanarak PRT'yi yeni bir örnek tüpüne aktarın. Şimdi örnek tüpünü düzgün şekilde etiketleyip kapapan.
Örneklenen uzunluk 50 milimetreden azsa, deneğe bir ila üç dakika dinlenmesini söyleyin ve ardından aynı gözle gözyaşı sıvısı toplamayı tekrarlayın. Her yeni örneklenen PRT'yi ayrı bir örnek tüpüne yerleştirin. Metanol ve temiz kağıt mendil kullanarak, eldivenleri ve pensleri dikkatlice temizleyerek gözyaşı kalıntılarını veya kirleticileri yok edin.
Sonra tamamen hava ile kurumasına izin verin. Tüm örnek tüplerini parafilm ile mühürleyin ve geçici depolama için hemen -20 derece Celsius'ta veya uzun süreli depolama için -80 derece Celsius'ta saklayın. Mikro makas ve pensleri fenol kırmızı iplikleri işlemeden önce metanol ile önceden yıkayın.
Her fenol kırmızı iplikten yaklaşık ilk üç milimetre kadar bükülmüş kanca ucunu kesin. Örneklenen bölgeyi fenol kırmızısı boya önüne kadar iki milimetrelik parçalara ayırın ve bu segmentleri temiz 1,5 mililitrelik organik çözücü toleranslı mikrosantrifüj tüpü ile toplayın. Eğik kanca ucunu ve istenmeyen PRT bölgesini at.
Numuneleri çıkarmadan önce düşük sıcaklıkta tutmak için buzun üzerine koyun. Şimdi, her numuneye 232 mikrolitre buz soğukluğu kütle spektrometrisi kalitesinde metanol ekleyin ve 15 saniye boyunca girdabı ekleyin ve iyice karıştırın. Örnekleri önceden soğuttulan ultrasonik temizleyicide 15 dakika sonikle geçirin.
Sonra her numuneye 774 mikrolitre HPLC kalitesinde metil tert-bütil eter ve 194 mikrolitre deiyonize su eklenin. Çözücüleri iyice karıştırmak için tekrar 15 saniye vortex yapın. Örnekleri önceden soğutulmuş ultrasonik temizleyicide tekrar 15 dakika daha soniklendirin.
Sonikasyon sonrası, örnekleri dört derece Celsius derecesine ayarlanmış bir TermoMikserde sekiz saat boyunca dakikada 1.200 devirde sallayarak kuluçka edin. Sonra karışımı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden bekletin. Karışımları 10.000 G'de 10 dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüjlendirin.
Santrifüjlemeden sonra, karışımların iki farklı sıvı faza ayırıldığından emin olun. Lipid içeren üst organik fazdan 700 mikrolitre dikkatlice toplayın ve önceden soğutulan, yeni 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Alt sulu faz, tehlikeli kimyasal atık olarak metil tert-bütil eter ve metanol içeren atılır.
Lipid özlerini, dört saat boyunca dört derece Celsius sıcaklığında ayarlanmış buzdolabında SpeedVac konsantratör ile kurutun. Kurutulmuş lipid özleri kısa süreli depolama için eksi 20 derece Celsius'ta veya uzun süreli depolama için eksi 80 derece Celsius'ta saklanır. Metanol-kloroform çözücü karışımını metanol ile kloroformu bire bir hacim oranında karıştırarak hazırlayın.
Kurutulmuş lipid özlerini, buz gibi soğukkanlı metanol-kloroform çözücü karışımından 50 mikrolitre kullanarak yeniden yapılandırın. Yeniden oluşturulan çözeltiyi önceden soğutulmuş ultrasonik temizleyicide 15 dakika sonikle geçirin. Şimdi, yeniden oluşturulmuş lipid ekstraktlarını 14.000 G ve dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüj edin.
Ortaya çıkan süpernatantın 40 mikrolitresini dikkatlice cam bir iç ile donatılmış bir otomatik numune alan cam şişeye aktarın. Şişe, sıvı kromatografi tandem kütle spektrometrisi analizine hazırlanmak için yarıksız septum açık bir kapakla sıkıca kapatın. Katı kriterler kullanılarak, sırasıyla birinci, iki çoğaltma ve üç örnek grupta 773, 890 ve 1.025 benzersiz lipid türü tanımlandı.
Pozitif iyon modu ise %26 derece A, %13,2 derece B ve %60,8 derece C tanımladığı 1.302 lipid türü tespit etti. Negatif iyon modu, yaklaşık %8,2 A, %22,9 B ve %68,9 C derecesi tanımlamış 257 lipid türü tespit etti. Depolama ile ilgili varyasyonlara rağmen, üç örnek setinde tutarlı şekilde 394 benzersiz lipid türü tespit edilmiştir.
Üç ziyarette denek arası varyasyon katsayısı pozitif modda %21,5, negatif modda %31,3 idi. Bu protokol, tekrarlanabilir gözyaşı lipidomik analizi için standart bir iş akışının eksikliğini ele alır ve çalışmalar arası karşılaştırılabilirliği artırabilir. PRT tabanlı yöntemimiz tahrişi en aza indirir, hızlı gözyaşı toplama sağlar ve operatör değişkenliğini azaltır.
Gelecekteki araştırmalarımız, büyük gruplarda gözyaşı lipidomik biyobelirteçlerini doğrulayacak ve kişiselleştirilmiş tanılar için multiomikleri entegre edecektir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, gözyaşı lipidomik çalışmalarında tekrarlanabilirliği artırmak amacıyla fenol kırmızı iplikleri kullanarak insan gözyakı sıvı örnekleri toplamak için standart bir yöntemi özetlemektedir. İş akışı, lipid ekstraksiyonu ve analizi için sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisini (LC-MS/MS) içermektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyokimya
- Klinik Araştırma
Arka Plan
- Mevcut gözyakı toplama yöntemleri genellikle tahriş veya değişkenliğe yol açar.
- Standartlaştırma, güvenilir biyobelirteç keşfi için kritik öneme sahiptir.
- Fenol kırmızı iplikleri, gözyakı örnekleme için daha az invaziv bir alternatif sunar.
- LC-MS/MS, lipidomik analiz için sağlam bir platform sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Gözyağı lipidomik profilleme için tekrarlanabilir bir yöntem oluşturmak.
- Operatör değişkenliğini en aza indirmek ve çalışmalar arası karşılaştırılabilirliği geliştirmek.
- Gözyağı lipid biyobelirteçleri üzerinde gelecekteki araştırmaları kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Fenol kırmızı iplikler kullanarak gözyakı örnekleri toplamak.
- Bifazik ayırma yöntemiyle lipidlerin ekstraksiyonu.
- Lipit türlerinin LC-MS/MS ile analizi.
- Numunelerin stabilite için kontrollü sıcaklıklarda saklanması.
Ana Sonuçlar
- Pozitif iyon modunda 1.300'den fazla lipid türü tanımlanması.
- Numuneler arasında 394 benzersiz lipid türünün tutarlı tanımlanması.
- Pozitif modda 21,5% olarak ölçülen denekler arası değişkenlik.
- Yöntem, lipidomik çalışmaların tekrarlanabilirliğini ve karşılaştırılabilirliğini artırır.
Sonuçlar
- Fenol kırmızı iplik yöntemi tahriş ve değişkenliği azaltır.
- Standartlaştırılmış iş akışı, gözyakı lipidomik analizinin güvenilirliğini artırır.
- Gelecek çalışmalar, daha büyük gruplarda lipid biyobelirteçlerini doğrulamaya odaklanacak.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Standardized, minimally invasive tear fluid sampling is critical for robust lipidomic biomarker discovery in ocular and systemic disease research. The phenol red thread (PRT)-based protocol addresses reproducibility and operator variability, enabling higher predictive confidence in early biomarker validation. This workflow supports translational continuity from discovery to preclinical research by ensuring consistent, high-quality lipidomic data across studies and sites.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables reproducible interrogation of tear lipid profiles for biomarker hypothesis testing.
- Reduces biological and procedural variability, supporting functional target validation.
- Facilitates portfolio triage by providing robust, quantitative lipidomic datasets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tear fluid samples for downstream high-resolution LC-MS/MS workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization by minimizing operator-dependent variability.
- Supports scalable, user-friendly sample collection suitable for multi-site studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lipidomic outputs with disease-relevant biomarker discovery and monitoring.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation by supporting consistent sample quality.
- Reduces risk of false negatives in translational biomarker studies due to sampling artifacts.
Pipeline & Workflow Integration
The PRT-based sampling protocol integrates into the biomarker discovery continuum, from early hypothesis testing to preclinical validation, by providing a standardized input for lipidomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven lipidomic profiling and pathway clarification in ocular and systemic disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative tear lipid samples for high-throughput LC-MS/MS analysis.
- Analytics: Enables identification and comparison of over 700 unique lipid species across replicates and conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and disease monitoring through robust, minimally invasive sampling.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, standardized protocol adaptable across research teams and clinical cohorts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipid biomarker studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of tear fluid collection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by reducing sampling-related risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires personnel trained in standardized PRT handling and sample processing.
- Needs access to high-resolution LC-MS/MS instrumentation and lipidomics software.
- Demands cross-team adherence to contamination control and storage protocols.
- Adaptable to subjects with low tear volume or sensitivity to traditional sampling methods.
- Potential limitations include storage-related lipid variability and need for further validation in large cohorts.
