Nekroptoz Sırasında Lizozomal Membran Geçirgenliğinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Bu protokol, lizozomal membran bütünlüğünde ve asitleşmede değişimi tespit eden floresan problar kullanılarak nekroptoz sırasında lizozomal membran permeabolizasyonunu izlemek için canlı hücre görüntüleme yöntemini tanımlar. Alandaki zorluk, hücre ölümü sürecinde zarar gören organellerin dinamikini karakterize etmek ve bu hasarın hücre yokluğuna nasıl yol açması veya katkıda bulunması gerektiğini kesin olarak tanımlamaktır. Başlamak için, 5.000 hücreyi iki mililitre antibiyotikle takviyeli DMEM ortamında steril bir cam tabanlı kaba yerleştirin.

Tabağı %5 karbondioksit ile 37 derece Celsius sıcaklığına ayarlanmış bir kuluçka makinesine yerleştirin ve hücreleri gece boyunca kuluçkaya geçirin. 20 mikrolitre dekstran yeşil boncukları mililitrede 25 mikrogram ile taze antibiyotikli DMEM ortamında seyreltirin. Eski ortamı tabaktan çıkarın ve yerine iki mililitre dana eti içeren takviyeli DMEM ortamı ekleyin.

Tabağı, %5 karbondioksit içeren 37 derece Celsius sıcaklığa ayarlanmış bir kuluçka makinesine yerleştirin ve boncukların lizozomlara içselleştirilmesi için 24 saat kuluçka yapın. Şimdi iki mililitre taze DMEM ortamına bir milimolar LysoTracker stok çözeltisi iki mikrolitre ekleyin. Eski ortamı bu boyama çözeltisiyle değiştirin.

Hücreleri %5 karbondioksit ile 37 derece Celsius sıcaklığında iki saat boyunca kuluçka yapın. Konfokal sistem bileşenlerini kişisel bilgisayar, mikroskop, tarayıcı gücü, lazer gücü, lazer emisyonu ve Leica gücünü açarak açın. Çevre kontrollerini açın; sıcaklık kontrolcüsü (Cube) ve karbondioksit gaz mikser kontrolcüsü (Brick) dahil.

Karbondioksit ve oksijen kaynağını açın. Sıcaklık kontrolünü 37 derece Celsius'a ayarlayın. Gaz ve nem kontrolünü %5 karbondioksit ve %95 nem olarak ayarlayın.

Görüntüleme odasını birleştirin. Boyamadan sonra hücreleri iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın, ardından iki mililitre taze takviyeli DMEM ortamı ekleyin. Görüntülemeden önce objektif lense daldırma yağı uygulayın.

Çanakları mikroskop aşamasına monte edin. Lazer yoğunluğunu %3'e kadar ama %5'ten fazla olmamasını sağlayın. Sonra sinyali optimize etmek için mikroskop yazılımında dedektör kazancını ayarlayın. Kontrast çubuğunu ayarlayarak arka planı minimize edin.

Kontrol koşulu olarak hizmet eden tedavi edilmemiş hücrelerin temel görüntülerini alın. Plakayı laminar akış başlığına geri getirin ve hücre ölümü indüktörleriyle takviye edilmiş bir mililitre antibiyotik DMEM ekleyin. Edinim yazılımında modu XYT, formatı 512 x 512, hız 400, zoom üç, satır ortalaması bir, çizgi birikimi üç, kare birikimi bir, zaman aralığını üç dakika, süre sekiz saat ve otomatik odaklama etkinleştirin.

Time-Lapse satın alma işlemini başlatmak için başlat düğmesine tıklayın. İlk görüntüleme, LysoTracker'ın stabil noktası ve floressein etiketli dekstran varlığını doğruladı; bu da tedaviden önce sağlam lizozomları gösteriyor. TSZ tedavisinden dört saat sonra LyoTracker floresansı belirgin şekilde azalmış, dextran ise dizilmiş sitozolik dağılım göstermeye başlamış, bu da başlangıçta lizozomal membran geçirgenliğini gösteriyor.

Tedaviden sekiz saat sonra LysoTracker'ın sinyali neredeyse tamamen kaybolmuştu, birçok hücre ise yeşil dekstran punktta ve dağınık yeşil sitozolik sinyal taşıyordu. Lizozomal membran permeabolizasyonunun, nekroptotik indüksiyon geçiren canlı bir hücrede doğrudan görselleştirilebileceğini gösterdik. Bu protokol, hem LysoTracker hem de dextran boncuklarının birleşiminin lizozomal pH ve kargo salınımının gerçek zamanlı olarak eşzamanlı olarak izlenmesini mümkün kıldığını göstermektedir.

Bu canlı hücre görüntü protokolünün ilerlemesi için önemli olan ise, küçük bir pH değişimini ve lizozomal membran geçirimliliğini gerçek zamanlı izleyebilme yeteneğidir; akış sitometrisi ve tek katmanlı boyama gibi uç nokta analizinde gözden kaçan dinamik olayları yakalayabilir.