Name: İnsan termi plasenta dokularından HLA-G+ ekstravillous trofoblastların fenotipleme ve fonksiyonel analiz için arındırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Öğrenin, insan plasenta dokularından HLA-G⁺ ekstravilloz trofoblastların izolasyonu ve fenotipleme yöntemini. Bu protokol, maternal-fetal arayüzde immünolojik etkileşimleri incelemek için yüksek canlılıkta hücre sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Papuchova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+HLA-G%2B+extravillous+trophoblasts+that+have+distinct+immune+regulatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Three types of HLA-G+ extravillous trophoblasts that have distinct immune regulatory properties.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (27), 15772-15777 (2020).</li>
<li>Hamilton, I., Ikumi, N. M., Kshirsagar, S., Goodman, W. A., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+primary+HLA-G%2B+extravillous+trophoblasts+and+HLA-G%2B+EVT-like+cell+lines+to+study+maternal-fetal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Utilizing primary HLA-G+ extravillous trophoblasts and HLA-G+ EVT-like cell lines to study maternal-fetal interactions.</a> STAR Protoc. 4 (2), 102276(2023).</li>
<li>Tilburgs, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+HLA-G%2B+extravillous+trophoblasts%3A+Immune-activating+cells+that+interact+with+decidual+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human HLA-G+ extravillous trophoblasts: Immune-activating cells that interact with decidual leukocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7219-7224 (2015).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progestogen-driven+B7-H4+contributes+to+onco-fetal+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Progestogen-driven B7-H4 contributes to onco-fetal immune tolerance.</a> Cell. 187 (17), 4713-4732.e19 (2024).</li>
<li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+profile+of+first+trimester+villous+and+extravillous+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells.</a> Placenta. 32 (1), 33-43 (2011).</li>
<li>Apps, R., Gardner, L., Hiby, S. E., Sharkey, A. M., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+human+leucocyte+antigen-C+molecules+at+the+surface+of+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Conformation of human leucocyte antigen-C molecules at the surface of human trophoblast cells.</a> Immunology. 124 (3), 322-328 (2008).</li>
<li>Moffett, A., Loke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+placentation+in+eutherian+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology of placentation in eutherian mammals.</a> Nat Rev Immunol. 6 (8), 584-594 (2006).</li>
<li>Papúchová, H., Meissner, T. B., Li, Q., Strominger, J. L., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dual+role+of+HLA-C+in+tolerance+and+immunity+at+the+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The dual role of HLA-C in tolerance and immunity at the maternal-fetal interface.</a> Front Immunol. 10, 2730(2019).</li>
<li>Vander Zwan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+signature+of+activation+and+dysfunction+allows+human+decidual+CD8%2B+T+cells+to+provide+both+tolerance+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed signature of activation and dysfunction allows human decidual CD8+ T cells to provide both tolerance and immunity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (2), 385-390 (2018).</li>
<li>Salvany-Celades, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+functional+regulatory+T+cells+control+T+cell+responses+at+the+human+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Three types of functional regulatory T cells control T cell responses at the human maternal-fetal interface.</a> Cell Rep. 27 (9), 2537-2547.e5 (2019).</li>
<li>Mahajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+decidual+CD8%2B+T+cells+include+distinct+effector+memory+and+tissue-resident+memory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific decidual CD8+ T cells include distinct effector memory and tissue-resident memory cells.</a> JCI Insight. 8 (17), e171806(2023).</li>
<li>Crespo, ÂC., Strominger, J. L., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+KIR2DS1+by+decidual+natural+killer+cells+increases+their+ability+to+control+placental+HCMV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of KIR2DS1 by decidual natural killer cells increases their ability to control placental HCMV infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 15072-15077 (2016).</li>
<li>Burton, G. J., Redman, C. W., Roberts, J. M., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-eclampsia%3A+Pathophysiology+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Pre-eclampsia: Pathophysiology and clinical implications.</a> BMJ. 366, 12381(2019).</li>
<li>Inada, K., Shima, T., Nakashima, A., Aoki, K., Ito, M., Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+regulatory+T+cells+in+decidua+of+miscarriage+cases+with+abnormal+or+normal+fetal+chromosomal+content%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of regulatory T cells in decidua of miscarriage cases with abnormal or normal fetal chromosomal content.</a> J Reprod Immunol. 97 (1), 104-111 (2013).</li>
<li>Tsuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+expanded+decidual+effector+regulatory+T+cells+increase+in+late+gestation+of+normal+pregnancy+but+not+in+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonally expanded decidual effector regulatory T cells increase in late gestation of normal pregnancy but not in preeclampsia.</a> Front Immunol. 9, 1934(2018).</li>
<li>Tsuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cell+heterogeneity+in+gestational+age+and+preeclampsia+using+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cell heterogeneity in gestational age and preeclampsia using single-cell RNA sequencing.</a> Front Immunol. 15, 1401738(2024).</li>
<li>Pique-Regi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+signatures+of+the+human+placenta+in+term+and+preterm+parturition%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional signatures of the human placenta in term and preterm parturition.</a> eLife. 8, e52004(2019).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+developmental+deficiencies+in+placentation+and+decidualization+in+late-onset+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals developmental deficiencies in placentation and decidualization in late-onset preeclampsia.</a> Front Immunol. 14, 1142273(2023).</li>
<li>Morita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+TCR+repertoire+and+PD-1+expression+in+decidual+and+peripheral+CD8%2B+T+cells+reveals+distinct+immune+mechanisms+in+miscarriage+and+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of TCR repertoire and PD-1 expression in decidual and peripheral CD8+ T cells reveals distinct immune mechanisms in miscarriage and preeclampsia.</a> Front Immunol. 11, 1082(2020).</li>
<li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proportion+of+peripheral+blood+and+decidual+CD4%2B+CD25bright+regulatory+T+cells+in+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Proportion of peripheral blood and decidual CD4+ CD25bright regulatory T cells in pre-eclampsia.</a> Clin Exp Immunol. 149 (1), 139-145 (2007).</li>
<li>Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidual+and+peripheral+blood+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells+in+early+pregnancy+and+spontaneous+abortion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy and spontaneous abortion.</a> Mol Hum Reprod. 10 (5), 347-353 (2004).</li>
<li>Shannon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+assessment+of+primary+and+stem+cell-derived+human+trophoblast+organoids+as+placenta-modeling+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell assessment of primary and stem cell-derived human trophoblast organoids as placenta-modeling platforms.</a> Dev Cell. S1534-5807, 00043-00051 (2024).</li>
<li>Apps, R., Murphy, S. P., Fernando, R., Gardner, L., Ahad, T., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">HLA expression of primary trophoblast cells and placental cell lines.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li>
<li>Okae, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+trophoblast+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of human trophoblast stem cells.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63.e6 (2018).</li>
<li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+screening+in+human+trophoblast+stem+cells+reveals+shared+and+distinct+aspects+of+placental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">CRISPR screening in human trophoblast stem cells reveals shared and distinct aspects of placental development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (51), e2311372120(2023).</li>
<li>Hori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+stem+cell-based+organoid+models+of+the+human+placental+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Trophoblast stem cell-based organoid models of the human placental barrier.</a> Nat Commun. 15 (1), 962(2024).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+multi-omic+profiling+of+human+placental+syncytiotrophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus multi-omic profiling of human placental syncytiotrophoblasts.</a> Nat Genet. 56 (2), 294-305 (2024).</li>
<li>Ikumi, N. M., Koenig, Z., Mahajan, S., Gray, C. M., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+primary+human+placental+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of primary human placental leukocytes.</a> STAR Protoc. 4 (2), 102277(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Santrifüj tüpleri</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-955-238</td><td></td></tr><tr><td>-20&nbsp;&deg;C dondurucu</td><td>herhangi bir tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C 5% CO2 İnkübasyonu</td><td>herhangi bir tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg;C buzdolabı</td><td>herhangi bir tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konik Santrifüj tüpleri</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-955-240</td><td></td></tr><tr><td>55 mM &beta;-Merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>6 &frac12;&rdquo; makas</td><td>herhangi bir tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-AAD Canlılık Boyama Solüsyonu</td><td>Biolegend</td><td>420403</td><td></td></tr><tr><td>-80&nbsp;&deg;C dondurucu</td><td>herhangi bir tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>REPROCELL</td><td>04-0014</td><td></td></tr><tr><td>AF700, fare, IgG1 k İzotip Kontrolü</td><td>Biolegend</td><td>400144</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 Rat IgG2a, &kappa; İzotip Kontrolü</td><td>Biolegend</td><td>400524</td><td></td></tr><tr><td>B7H3 PE/Dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>351012</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSymphony A5 SE Hücre Analizörü</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bigfoot Spectral Hücre Ayırıcı</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boğa Serum Albumini (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>BSL2 biyogüvenlik kabini</td><td>herhangi bir tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV605 Fare IgG1, &kappa; İzotip Kontrolü</td><td>BD Biosciences</td><td>562652</td><td></td></tr><tr><td>BV750 Fare IgG1, &kappa; izotip Kontrolü</td><td>Biolegend</td><td>400105</td><td></td></tr><tr><td>BV785 Fare IgG1, &kappa; İzotip Kontrolü</td><td>Biolegend</td><td>400170</td><td></td></tr><tr><td>CD45 BV785</td><td>Biolegend</td><td>304048</td><td></td></tr><tr><td>Hücre ayrıştırma elek</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>CD1-1KT (örgü boyutu 60)</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeçleri 40&micro;m, 70&micro;m, 100&micro;m</td><td>Thermo Fisher</td><td>22363547; 22363548; 22363549</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent kaspaz-3/7 Yeşil Algılama Reaktifi</td><td>invitrogen</td><td>C10423</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>herhangi bir tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021, 3mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML 1046-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Eğri uçlu pense</td><td>herhangi bir tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit (DMSO)</td><td>VWR Life Science</td><td>97063-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads İnsan T-Aktivatör CD3/CD28 T Hücre Genişlemesi ve Aktivasyonu için</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>EGF, İnsan, Rekombinant, Hayvan İçeriği Yok</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>EGFR1 BV711</td><td>Biolegend</td><td>352920</td><td></td></tr><tr><td>FACS DIVA yazılımı</td><td>BD Biosciences</td><td>https://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque Plus</td><td>Cytivia</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Yazılımı</td><td>FlowJo</td><td>https://www.flowjo.com/</td><td></td></tr><tr><td>HLA-C PE</td><td>BD Biosciences</td><td>566372</td><td></td></tr><tr><td>HLA-E PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>342608</td><td></td></tr><tr><td>HLA-G APC</td><td>abcam</td><td>AB40915</td><td></td></tr><tr><td>İnsan AB serumu</td><td>Corning</td><td>35060CI</td><td></td></tr><tr><td>İnsan koryonik gonadotropin (hCG) (2500IU/mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1063</td><td></td></tr><tr><td>İnsan fibronektin (1mg/mL)</td><td>Corning</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>İnsan rekombinant IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Insülin-Transferrin-Selenyum, 100x (ITS-G)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>ITGA6 APC/cy7</td><td>Biolegend</td><td>313627</td><td></td></tr><tr><td>L-Askorbik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>mıknatıslı ayırıcı</td><td>promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr><tr><td>Yeni Doğan Dana Serumu (NCS)</td><td>gibco</td><td>16010-159</td><td></td></tr><tr><td>PD-L1 AF700</td><td>invitrogen</td><td>56-5983-42</td><td></td></tr><tr><td>PD-L2&nbsp; BV750</td><td>Biolegend</td><td>345528</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 fare, IgG1 k, İzotip Kontrolü</td><td>Biolegend</td><td>400126</td><td></td></tr><tr><td>PE/Dazzle594 Fare IgG1, &kappa; İzotip Kontrolü</td><td>Biolegend</td><td>400176</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin ve Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin 10X Çözeltisi</td><td>ThermoFisher</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td>PVR BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>748276</td><td></td></tr><tr><td>Araştırma sınıfı FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB12999102</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep İnsan CD8+ T Hücresi Zenginleştirme Kokteyli</td><td>Stem Cell</td><td>15023</td><td></td></tr><tr><td>SB431542. 10 mM</td><td>Apex-Bio</td><td>A8249</td><td></td></tr><tr><td>Salınımlı su banyosu 37&nbsp;&deg;C</td><td>herhangi bir tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express 1x Fenol Kırmızısız</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>VPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>X

İnsan termi plasenta dokularından hla-g+ ekstravillous trofoblastların fenotipleme ve fonksiyonel analiz için arındırılması

Purification of HLA-G+ Extravillous Trophoblasts from Human Term Placental Tissues for Phenotyping and Functional Analysis

Beklenen hücre verimleri
15 mL decidua bazalis'ten beklenen HLA-G+ EVT, ilk sindirimden 106 hücre × 0,1-0,3 hücre ve ikinci sindirimden 0,1-0,6 × 106 hücre (toplamda 0,2-0,8 × 106 hücre) verir. 30 mL korionik zardan beklenen HLA-G+ EVT verimleri ilk sindirimden 106 hücre × 0,4-1,0 ve ikinci sindirimden 0,4-1,5 × 106 hücre (toplamda 0,8-2,5 × 106 hücre) olarak belirlenir. İzolatlarda kaspaz 3/7-7-AAD- canlı EVT oranının %90-95 olması beklenmektedir.
Birincil HLA-G+ EVT kültürü
Soy belirteçleri (HLA-G, HLA-C, EGFR) ve hücre ölüm belirteçlerinin akış sitometrisi analizi, bu protokolün 4. güne kadar (sıralanmış EVT kaplamasından 96 saat sonra) kadar geçerli birincil EVT kültürü sağladığını göstermiştir (Şekil 1B-D). Birincil koriyonik ve d.basalis HLA-G+ EVT'nin temsil ışık mikroskopisi görüntüleri, 24, 48 ve 72 saat kültür sonrası gösterilmiştir (Şekil 2A-F).
Primer HLA-G+ EVT'nin T hücreleriyle birlikte kültürlenmesi
Bu protokol, plasentadan izole edildikten sonra primer EVT'nin 96 saat uygulanabilirliğini artırdı; bu, öncekiraporumuz 1,2,10'a kıyasla bir iyileşme oldu. Bu nedenle, önceden uyarılmış lenfositlerle birlikte kültür sonrası EVT yanıtlarının analizini mümkün kılar; bu da anne-fetal arayüzdeki akut iltihabı taklit eder. EVT, hücredışı akış sitometrisi boyama ile belirlenen PD-L1, PD-L2, PVR (CD155 olarak da bilinir), B7H3 ve HLA-E gibi polimorfik HLA-C ile birlikte immüniterif ko-inhibitör molekülleri ifade eder (Şekil 3A,B). EVT, protokol bölümü 8'e göre (Şekil 4A,B) protokol bölümüne göre, aktif lenfositlerle 72 saat boyunca birlikte kültürlendiğinde PVR ve B7H3 ekspresyonunu artırmadı. Ayrıca, 7AAD ve kaspaz 3/7 boyama ile gösterildiği gibi EVT ölümünde artış gözlemlenmedi (Şekil 4C,D).
<img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Şekil 1. EVT hücre sıralaması için kapı stratejisi ve düzenlenmiş EVT kültürlendikten sonra akış sitometrisi grafikleri. (A) Decidua bazalis EVT ve korionik EVT'nin ayırılması için temsil edilen kapı stratejisi. R1, İleri-Yan Dağılma grafikindeki canlı hücre kapısıdır. R2, CD45+ lökositlerin dışlanması için kullanılan kapıdır. R3, HLA-G+EGFR+EVT kapısıdır. R4, 7-AAD-kaspaz3/7- canlı EVT'dir. R4 kapısı sıralama için mutlaka gerekli olmasa da, burada birincil EVT'nin uygulanabilirliğini göstermek için gösterilmiştir. (B) 96 saat in vitro kültür sonrasında sıralanmış HLA-G+EGFR+EVT'nin temsil akış sitometrisi grafikleri. (C,D) Kaspazın sıklıkları 3/7- 7-AAD- çevrim sırasında (0. gün) ve kültürün 96 saatinde (4. gün) canlı EVT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Şekil 2. In vitro kültür sırasında EVT'nin morfolojisi. (A) 24 saat, (B) 48 saat ve (C) 72 saat kültür ve decidua bazalis EVT'nin (D) 24 saat, (E) 48 saat ve (F) 72 saat kültür sonrası koryonik EVT'nin temsil ışık mikroskopisi görüntüleri. Ölçek çubuğu = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Şekil 3. Primer EVT'nin immünolojik fenotipleri. (A) Birincil EVT'de HLA'ların ve ko-inhibitör moleküllerin temsil akış grafikleri, hücre dışı akış sitometri boyama ile belirlenmiş (0. gün). (B) Eşleştirilmiş çizgi grafikleri, 0. günde IgG kontrolünün ham MFI'sini ve her işaretçiyi d. basalis EVT (mavi) ve koryonik EVT (yeşil) ile tam boyayı gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Şekil 4. Aktif lenfositli veya aktif lenfositsiz primer EVT'nin immünolojik fenotipleri (4. gün). (A) 72-saat kültüründen sonra (4. gün) aktif üçüncü taraf lenfositlerle veya olmadan EVT'nin temsil akış grafikleri. (B) Eşleştirilmiş çizgi grafikleri, aktif üçüncü taraf lenfositlerle veya olmadan EVT'nin MFI'sini gösterir. Mavi grafikler decidua basalis EVT'yi, yeşil grafikler ise korionik EVT'yi temsil eder. (C) 4. günde aktif üçüncü taraf lenfositlerle veya olmadan kaspaz 3/7-7-AAD- canlı EVT için temsil akış sitometri grafikleri. (D) Eşleştirilmiş çizgi grafikleri, üçüncü taraf lenfositlerin aktif olup olmadığı kaspazlar 3/7-7-AAD- canlı EVT frekanslarını gösterir. Mavi grafikler decidua basalis EVT'yi, yeşil grafikler ise korionik EVT'yi temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1. Doku diseksiyonu ve sindirim için önemli reaktiflerdir. Ayrıcabkz. 1,2,24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/Table%201_final.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 2. EVT kültürü için anahtar reaktifler ve T hücreleriyle birlikte kültür yapılır. Ayrıcabkz. 1,2,24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/Table%202_v2_final.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 3. Sıralama ve akış sitometrisi analizi için anahtar antikorlar ve reaktifler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/Table%203_final.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

İnsan termi plasenta dokularından HLA-G+ ekstravillous trofoblastların fenotipleme ve fonksiyonel analiz için arındırılması

The human maternal-fetal interface represents a unique immunological environment where maternal immune cells and fetal extravilllous trophoblasts (EVT) ...

purification-hla-g-extravillous-trophoblasts-from-human-term

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz, gelişimi sırasında büyük bir hematopoetik organ olarak plasenta tespit ettik. Biz, hematopoietik kök hücreler (HKH'lerin) üretilen ve benzersiz microenvironmental nişler içinde plasenta genişletilmiş iki bulundu. Burada, fare plasenta HKH'lerin izolasyonu ve görselleştirme için gerekli deneysel teknikler açıklanmaktadır.

Plasenta Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu ve Analizi

Bu protokol, biz bir Percoll gradyanı kullanılarak trofoblast hücrelerinin izolasyonu takiben gebelik d10.5 üzerinde fare plasenta diseksiyonu tarif. Daha sonra bir Matrigel işgali tayininde izole hücrelerin kullanımını göstermektedir.

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

Monoklonal antikorlar TG30 (CD9) ve GCTM-2'nin floresan aktif hücre sıralama (FACS) yoluyla hücre yüzeyi antijenlerinin kombine tespiti için pozitif seçim kullanılarak canlı insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC) tanımlanması ve zenginleştirilmesi ve ayrıca hESC'lerin karışık hücre popülasyonundan arındırılması için negatif seçimin kullanılmasını açıklıyoruz.

Monoklonal Antikorlar TG30 ve GCTM-2 Kullanılarak Hücre Yüzey Antijenlerinin Tespiti ile İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Zenginleştirilmesi ve Temizlenmesi

Burada açıklanan, insan maternal-fetal arayüzü olan decidua basalis ve decidua parietalis'in sızan lökositlerini izole etmek ve daha fazla incelemek için bir protokoldür. Bu protokol, hücre yüzeyi belirteçlerinin bütünlüğünü korur ve akış sitometrisi analizi ile kanıtlandığı gibi aşağı akış uygulamaları için yeterli canlı hücre verir.

İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Bu protokol, etkili bir şekilde, taze izole edilmiş beşeri villöz sitotrofoblastlar siRNA transfekte gözeneklendirilmesinin kullanılarak bu hücrelerde DNA-protein kompleksleri tanımlanması için bir yöntem tarif eder. Transfekte edilen hücreler, Western Blot ile izlenebilir ve EMSA 4-günlük kültür döneminde analiz eder.

Taze izole edilmiş insan Villöz sitotrofoblastlar ilgili siRNA transfeksiyonu ve EMSA analizi

Bu el yazması, hipoksi/reoksijenasyon altında kültürlenen, immün olarak saflaştırılmış insan villöz sitrofoblast hücrelerinin benzersiz bir in vitro modelini sunmaktadır. Bu model, melatonin gibi umut verici tedavilerin, artmış oksidatif stres ve değişmiş plasenta fonksiyonu ile ilişkili gebelik komplikasyonları üzerindeki koruyucu etkilerini incelemek için uygundur.

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

Burada, kemik morfojenik protein 4 ve Aktivin/Nodal yolların inhibitörlerini kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinden verimli bir şekilde insan trofoblastik hücreleri üretmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, insan pluripotent kök hücrelerinin verimli bir şekilde farklılaşması için uygundur ve genetik manipülasyon için büyük miktarlarda hücre üretebilir.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

Bu çalışmada tersinir doku takas, immunostaining, 3D işleme ve analiz insan plasenta villus örneklerinde sırasına 1-2 mm3damar ağları için bir protokol sunar.

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları

Bu iletişim kuralı bir yöntem için birincil insan decidual hücreleri çeşitli uygulamalar (Yani immunocytochemistry, Akış Sitometresi, vb) için kullanılan terim placentae fetal membranlar toplanan yalıtım gösterir hedefleyen farklı hücre popülasyonlarının gebelik komplikasyonları olarak rol çalışmak için.

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

Burada, vitrifiye insan blastosistlerinin ısınması, in vitro implantasyon dönemi boyunca ekinde, tek hücrelere sindirilmesi ve daha fazla araştırma için erken trofenlast hücrelerinin toplanması için bir yöntem tanımlıyoruz.

Peri-implantasyon Aşamasında Trophoblast Hücrelerinin Tek Hücre Li Hücre Koleksiyonu İnsan Embriyoları

Bu protokol, viral enfeksiyonların incelenmesi için hava-sıvı arayüzünde kültürlenen insan plasenta dokusu eksplantlarının hazırlanmasını açıklar.

Ex vivo Anne-Fetal Arayüzü üzerinden viral iletimin incelenmesi için insan plasenta eksplantlarının kültürü

Öğrenin, insan plasenta dokularından HLA-G⁺ ekstravilloz trofoblastların izolasyonu ve fenotipleme yöntemini. Bu protokol, maternal-fetal arayüzde immünolojik etkileşimleri incelemek için yüksek canlılıkta hücre sağlar.

İnsan termi plasenta dokularından HLA-G⁺ ekstravillous trofoblastların fenotipleme ve fonksiyonel analiz için arındırılması

Daha fazla video keşfet