İnsan termi plasenta dokularından HLA-G⁺ ekstravillous trofoblastların fenotipleme ve fonksiyonel analiz için arındırılması

Bu protokol, insan plasenta dokularından birincil insan trofoblastlarını arındırarak sağlıklı gebelikte ve patolojik koşullarda fonksiyonel ve immünolojik özelliklerini incelemek amacıyla tasarlanmıştır. Bu protokol, birincil insan ekstravillous trofoblastlarıyla çalışmadaki önceki bazı sınırlamaları, yani onların canlılık koşullarını aşmak için tekrarlanabilir bir platform sağlar. Bu protokol, onların geçerliliğini ve saflığını artırmak için gerçekten optimize edilmiş.

Başlamak için, insan plasentası örneği alın. Plasentayı fetal tarafı yukarıya bakacak şekilde yerleştirin, böylece kordon yerleşim yeri görünür olsun. Amniyonu yan membrandan göbek kordonunun yerleşim yerine doğru elle soyup çıkarın.

Sonra makasla amniyonu kesip at. Koriyodecidual zarı plasentanın tabanından yukarıya doğru iki inçlik şeritlere kesin ve her şeridi plasentaya bağlı tutun. Koriyodesidual membran şeridini, desidual tarafı yukarıya bakacak şekilde iki parmak boyunca yerleştirin.

Steril kıvrımlı uçlu bir çift forseps ile maternal decidua parietalis'i koriondan nazikçe kazıyın. Decidua parietalis'i, lenfosit izolasyonu için 20 mililitre PBS içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. Daha sonra koryonik zarı, içinde 20 mililitre yıkama malzemesi olan ayrı bir 50 mililitrelik konik tüpe halinde toplayın. Makasla, 50 mililitrelik tüpün içindeki koryonik zarı iki milimetrekareden daha küçük parçalara kesin.

Tüpten yıkama ortamı A'yı atın. Yüzey şeffaf olana kadar dokuyu PBS ile tekrar tekrar yıkayın. Plasenta diseksiyon için, plasentayı anne tarafı yukarıya bakacak şekilde yerleştirin ve kan pıhtılarını çıkarın.

Steril makas kullanarak, plasenta bazal plaka parçalarını kesin ve nekrotik, kalsifik veya iskemik bölgelerden kaçının. Decidua basalis parçasını parmakların üzerine koyun, villiler yukarıya bakacak şekilde yerleştirin. Sonra makasla villusları dikkatlice çıkararak sadece ince bir villus tabakası kalan iki ila üç milimetrelik bir zar elde edin.

Decidua bazalis dokusunu 20 mililitre PBS içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe halinde toplayın. Sonra dokuyu iki milimetrekareden küçük parçalara doğrayın. Sonra, PBS'yi tüpten at.

Decidua basalis'i PBS ile defalarca yıka, süpernatan şeffaf olana kadar ve görünür kan olmadan yıkayın. Sonra 15 mililitre doku süspansiyonunu iki 50 mililitrelik konik tüpe ayırın. Tüm tüpleri PBS ile doldurun.

Tüpleri 200G ile bir dakika santrifüjle yapın ve süpernatantı dökün. 300 mililitrelik cam şişeye 150 mililitre sıcak doku sindirim enzim kokteyli ekleyin. Şişeye 30 mililitre koriyonik zar ekleyin.

20 mililitre sıcak DMEM/F-20 ve 80 mililitre sıcak doku sindirim enzim kokteylini iki ayrı 300 mililitrelik cam şişeye ekleyin. Sonra her şişeye 7,5 mililitre decidua basalis ekleyin. Şişeleri su banyosunda kuluçka yapın.

15 dakikalık kuluçka sırasında tüm şişeleri her üç-dört dakikada bir sallayın. Sindirimden sonra, dokuyu 40 ağ boyutuna sahip metal eleklerden filtreleyin. Sonra yıkama aracı B ekleyin, mendilleri durulamak ve jelatinimsi malzemeyi çözmektir.

Sindirilmemiş dokuyu tekrar cam şişelere aktarın ve sindirimi tekrarlayın. Daha sonra hücre süspansiyonlarını 100 mikrometrelik bir filtreden etiketlenmiş 50 mililitre konik tüplere filtreleyin. Birinci ve ikinci sindirimden hücreleri ayrı tutun.

Sonra hücre süspansiyonunu 650G ile sekiz dakika boyunca santrifüjlendirin. Üst yüzeyi at. Aynı doku tipi ve sindirim sayısına sahip peletleri tek bir tüpte birleştirin.

Sonra 25 mililitreye kadar yıkama aracı B ile hacmi yapın. 12 mililitre ficoll, doku tipi ve sindirim numarası ile etiketlenmiş dört 50 mililitrelik konik tüplere ekleyin. Hücre süspansiyonunu dikkatlice ficoll'un üzerine katmanlayın.

Sonra 800G'de oda sıcaklığında 20 dakika boyunca kırılmadan santrifüj yapın. Ficoll ortam arayüzündeki hücre tabakasını dikkatlice aspire edin ve temiz etiketli tüplere aktarın. Sonra tüpleri yıkama maddesi B ile doldurun, 650G'de sekiz dakika santrifüj yapın ve pelletleri tekrar süzülün.

Yeniden askılanan pelletleri, doku tipi ve sindirim numarasıyla etiketlenmiş steril floresansla aktive hücre ayırma tüplerine yerleştirin. Anti-CD45 BV785, anti-HLA GAPC ve anti-EGFR1 BV711 antikorları ekleyin. Oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika kuluçka yapın.

Hücreler yıkama ortamı B'de yıkanıp yeniden süzüldükten sonra hemen 40 mikrometrelik hücre süzgecinden geçirilin. CD45 negatif HLAG pozitif EGFR pozitif ekstravillous trofoblastı bir mililitre EVT kültür ortamı içeren tüplere ayırın A. Soy belirteçlerinin akış sitometrisi analizi, dördüncü güne kadar uygulanabilir primer ekstravillous trofoblast kültürünü gösterdi. Birincil koriyonik ve decidua bazalis HLAG pozitif ekstravillous trofoblastın temsil ışık mikroskobu görüntüleri, 24 saat, 48 saat ve 72 saat kültür sonrası çekildi.

Ekstravillous trofoblast, polimorfik HLAC ve immünosupresyif ko-inhibitör molekülleri ifade eder. Ekstravillu trofoblast, HLAC, PD-L1, PD-L2 ve HLA-E ekspresyonunu artırdı, ancak aktive lenfositlerle 72 saat boyunca birlikte kültürlendiğinde PVR ve B7H3 ekspresyonunu artırmadı. Aktive lenfositlerle birlikte kültür sonrasında ekstravillu trofoblast ölümünde artış gözlemlenmedi.

Bu protokol, bilim insanların, çok çeşitli testler için birincil ekstravillous trofoblastları kullanmasına olanak tanır. Faydası, hücre kültürü, soğuk kültür, akış sitometrisi, proteomik, transkriptomik kullanılarak bu çok iyi uygulanabilir yüksek verimli ekstravillous trofoblastlarla analiz yapılmasına olanak tanıyan yüksek canlılıktır. Protokolümüzün en önemli yönlerinden biri, taze plasenta malzemeleri kullanmanız gerektiğidir.

Onları buzdolabında saklayamazsınız. Trofoblastlar ölmeyi çok sever, bu yüzden lütfen plasental dokuları doğumdan hemen sonra, tercihen doğumdan sonraki iki saat içinde alın ve her zaman oda sıcaklığında tutun. Bu, yüksek verimli ekstravillou trofoblast elde etmek için çok önemlidir.

Bu birincil trofoblastları kullanabileceğiniz daha ek ve daha gelişmiş yöntemlerden biri uzun vadeli hücre kültürüdür. Yani birincil dört günlük hücre kültürlerini oluşturmak için onları kullanabilirsiniz. Yani hücreler 96 saate kadar canlı olur, bu oldukça uzun bir süreç ve bağışıklık hücreleriyle, örneğin T ve NK hücreleriyle soğuk kültürler yapmanızı sağlar.

Diğer yenilik ise, Aoki tarafından ilk tanımlanan yöntemlerle trofoblast benzeri hücre hatlarını oluşturmak için kullanılabilmemiz ve bu kültürlerde genom düzenleme ve diğer daha uzun vadeli kültür testleri için kullanılabilecek uzun vadeli çoğalan hücre tipleri oluşturmak için de kullandığımız bu kültürlerdir. Bu yenilikçi yöntemleri, uzun vadeli hücre kültürü de dahil etmek, genom düzenleme, nakavt, nakavt genleri, proteinleri uygulayabildiği, bazı trofoblastların aşırı eksprese edildiği ve bu trofoblastların toleransı nasıl sağladığına dair mekanik detayları daha ayrıntılı elde etmenize veya bağışıklık popülasyonlarıyla etkileşimde bulunduklarında bağışıklık ve daha fazla sitotoksisite sağladığınız uzun vadeli mekanistik kültürler tasarlamanıza gerçekten yardımcı olabilir.