CUT&RUN kullanılarak nöroendokrin küçük hücreli akciğer kanseri hücre hatlarında histon modifikasyonları ve transkripsiyon faktörü bağlanma noktalarının genom çapında haritalanması

Araştırmamızın amacı, farklı küçük hücreli akciğer kanseri türlerinde transkripsiyon faktörlerini belirleyen hatt ve kromatin yeniden şekillendiren proteinler arasındaki etkileşimleri belirlemek, transkripsiyon manzaralarını düzenlemek ve bu etkileşimlerin kanserin başlangıcı ve ilerlemesi dahil hastalık süreçlerine nasıl katkıda bulunabileceğini belirlemektir. Bunu, bu farklı şekilde değiştirilmiş histonların ve DNA'ya bağlı transkripsiyon faktörlerinin genomik konumlarını küresel ölçekte profil veya tanımlayabilen yeni nesil dizileme tekniği olan CUT&RUN gibi deneyler yaparak gerçekleştirmeyi hedefliyoruz. Sonuç olarak, bu çok agresif akciğer kanseri türüne sahip hastalar için yeni tedaviler geliştirmede terapötik olarak uygulanabilir olabilecek epigenetik olarak düzenlenmiş yeni yollar belirlemeyi umuyoruz.

Başlangıç olarak, 37 derece Celsius inküyatöründen kültürlenmiş küçük hücreli akciğer kanseri nöroendokrin hücrelerini çıkarın ve kalitelerinden emin olmak için mikroskop altında inceleyin. Sonra hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve tüpü 1.200 g ile oda sıcaklığında beş dakika boyunca santrifüj yapın. Konik tüpten ortamı kapüşondaki vakum kullanarak aspirasyon yapın ve ortaya çıkan hücre pelletini 20 mililitre PBS ile durulayın.

Tüpü tekrar 1.200 g ile beş dakika boyunca santrifüjle yapın ve PBS'yi aspire edin. Pellet boyutuna göre Accutase ekleyin ve hücre pelletini sindirmek için 37 derece Celsius'ta üç ila beş dakika kuluçka yapın. Sonra, beş mililitre PBS ile %10 FBS ekleyip karıştırarak tek hücre süspansiyonu elde ederek sindirimi sonlandırın.

Daha önce gösterildiği gibi hücreler tekrar santrifüjlendikten sonra, pellet beş mililitre PBS ile yeniden süzülür. Başlangıç hücrelerini sayın ve otomatik hücre sayacı kullanarak onların yaşamlılığını ve bütünlüğünü doğrulayın. Gerekli toplam hücre sayısını hesaplayın ve pipetleme hatalarını hesaba katmak için %20 fazla ekleyin.

Hesaplanan toplam hücre sayısını 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve tüpleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 600 g santrifüjle yapın. hücreleri, her reaksiyonda beş hücrenin gücüne beş kat 10 oranında yoğunlukta yıkama tamponuna yeniden askıya alın, böylece toplam altı reaksiyon olur. Her reaksiyon için 100 mikrolitre tampon kullanın ve pipet yapın, böylece eşit bir süspansiyon sağlanır.

Hücreleri tekrar santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve yıkamayı tekrarlayın. Yıkanmış hücrelerden 100 mikrolitre, aktif Concanavalin A boncukları içeren sekiz şeritli tüpün her birine 100 mikrolitre alıkoy. İçeriği karıştırmak için nazikçe pipet yapın.

Boncuk hücresi bulamaçını oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka edin, böylece hücreler boncuklara bağlanabilir ve boruların çökmesine izin vermeden çamur toplamak için tüpleri mini bir santrifüjde hızla döndürün. Tüpleri 0.2 mililitrelik bir tüp mıknatıs rafına yerleştirin. Çamurun temizlenmesine izin verin ve üst yüzeyi çıkarmak için pipetleyin.

Sonra tüpleri mıknatıstan çıkarın. Her reaksiyona hemen 50 mikrolitre buz gibi soğuk antikor tamponu ekleyin ve boncukları tekrar süslemek için nazikçe pipetleyin. Sekiz şerit tüpünü uygun şekilde etiketleyin.

Her reaksiyon tüpüne 0,5 mikrogram H3K4me3, H3K4me1 ve immünoglobulin G antikorları ile farklı kaynaklardan alınan 0,6 mikrogram E2F7 poliklonal antikor ekleyin. Her reaksiyon tüpünün içeriğini iyice karıştırmak için nazikçe pipet yapın ve dört derece Celsius'ta bir nutatorda tüp kapaklarını yükselterek gece boyunca kuluçka yapın. Nutatordan sekiz şerit tüpünü çıkarın ve her tüpün altındaki sıvıyı toplamak için hızlı bir dönüş yapın.

Şimdi tüpleri mıknatıs standına yerleştirin, çamur geçene kadar. Sonra dikkatlice pipetle süpernatı çıkarıp atın. Tüpleri mıknatıs standında tutarak, her tüpü 200 mikrolitre soğuk hücre geçirimlilik tamponu ile iki kez yıkayın ve her yıkamadan sonra süpernatantı çıkarmak için çok kanallı pipet kullanın.

Sonra, mıknatıs standından tüpleri çıkarın. Her reaksiyona hemen 50 mikrolitre soğuk hücre geçirgen tampon ekleyin ve hücreleri ve boncukları yeniden süsleyecek şekilde nazikçe pipetleyin. Daha sonra her reaksiyona 2,5 mikrolitre AG-mikrokokkal nükleaz proteini ekleyin ve nazikçe pipetle karıştırın.

Oda sıcaklığında 10 dakikalık kuluçkadan sonra, tüpleri hızlıca döndürün. Onları tekrar mıknatıs standına yerleştirin, çamur geçene kadar ve ardından üst yüzeyi çıkarın. Boncukları soğuk hücre geçirimlilik tamponu ile iki kez yıkandıktan sonra, onları 50 mikrolitre hücre geçirgen tamponunda nazikçe yeniden süzülür.

Tüpleri buz üzerinde tutarken, önceki adımdaki sekiz tüplü şeritte her reaksiyona bir mikrolitre 100 milimolar kalsiyum klorür ekleyin. Boncukları tamamen yeniden süslemek ve verimli sindirimi sağlamak için nazikçe pipet yapın. Tüpleri dört derece Celsius sıcaklığında bir nutatorda iki saat boyunca kuluçka yapın, tüp kapakları kuluçka boyunca yukarıda tutulur.

Şimdi yeni bir 1,5 mililitrelik tüpte, 33 mikrolitre stop buffer ile bir mikrolitre escherichia coli spike ile DNA'da 0,5 nanogram reaksiyon hızında stop buffer karışımını hazırlayın. Çözeltiyi karıştırmak için nazikçe vortex yapın. İki saatlik kuluçkanın sonunda, her reaksiyon tüpüne hazırlanmış stop buffer karışımından 33 mikrolitre ekleyin ve iyice karıştırın.

Reaksiyon tüplerini termosiklde 37 derece Celsius sıcaklıkta 10 dakika kuluçka yapın. Hızlı bir dönüşten sonra, boruları bir mıknatıs rafına yerleştirin, ta ki çözelti berrak hale gelene kadar. CUT&RUN salınım DNA'sını içeren süpernatanttan yaklaşık 85 mikrolitreyi dikkatlice taze 1,5 mililitrelik tüplere aktarın.

Kurtarılan DNA'yı arındırın, miktarını değerlendirin ve kalite kontrolü için parça boyut dağılımı gerçekleştirin. Sonra CUT&RUN kütüphane hazırlama, nicelik, indeksli kütüphane havuzlama ve eşleştirilmiş uçlu yeni nesil dizileme işlemlerine devam edin. Achaete-scute homolog-1 yüksek hücre hatları, DMS79 ve H146 ile Nörojenik Farklılaşma Faktörü 1 yüksek hücre hatları ile H82, yapışmayan agregalar veya süspansiyonda kompakt sferoidler olarak büyürken, H446 karışık morfoloji sergilerken, yaklaşık %80 doğal hücreler ve %20 süspansiyonda bulunmuştur.

CUT&RUN DNA fragment analizi, güçlendirici histon işareti H3K4me1'in tüm hücre hatlarında en yüksek DNA miktarını verdiğini, ardından H3K4me3'ün geldiğini, en düşük miktarları ise E2F7 ve IgG'nin verdiğini ortaya koydu. Ekstrakt edilen CUT&RUN DNA'sı için, H3K4me1 ve H3K4me3 için parça boyut dağılımı mono-nükleozom ve di-nükleozom ile genomik DNA için net zirveler göstermiştir. Buna karşılık, E2F7 veya IgG kontrolü için belirgin bir zirve tespit edilmedi.

Düşük DNA girdisine rağmen, E2F7 ve IgG dahil tüm CUT&RUN hedefleri için yeni nesil dizileme kütüphaneleri başarıyla oluşturuldu. DMS79 yabani tip ve H146 heterozigot mutant hücrelerde ısı haritası analizi, H3K4me3 ve E2F7 sinyallerinin transkripsiyon başlangıç noktalarına yakın zenginleştiğini, H3K4me1 sinyallerinin ise daha geniş bir şekilde dağıldığını gösterdi. Rastgele seçilmiş bir kromatin bölgesinde genom tarayıcı görselleştirmesi, H3K4me3, H3K4me1 ve E2F7 için belirgin zirveler gösterdi, IgG ise zenginleşme göstermedi.

Bu yüzden geleneksel olarak, bilim insanları ve araştırmacılar, sorduğumuz gibi soruları çözmek için kromatin immünopresipitasyonu ve ardından dizileme veya ChIP-seq kullanmışlardır. Ancak, ChIP-seq oldukça yüksek miktarda giriş materyali gerektirir ve bu her zaman uygulanabilir değildir, kullanılan modele bağlı olarak. CUT&RUN ise, 50.000 hücre kadar düşük bir giriş materyali gerektiriyor ve daha az yüksek verimli dizileme okumaları gerektiriyor, bu da daha az maliyetli ve veri üretiminde çok daha az arka plan sağlıyor.

CUT&RUN, sadece 2B kültürdeki hücrelere uygulanabilen bir tekniktir; aynı zamanda hasta kaynaklı organoidler ve ksenograftlar gibi diğer preklinik modeller için de uyarlanabilir. Ayrıca normal ve hastalıklı dokular dahil olmak üzere dokularda kromatin manzarasının profilini oluşturmak için de kullanılabilir. Bu teknoloji veya teknik, kanser araştırmacıları için inanılmaz derecede faydalı olsa da, farklı insan hastalıklarını incelemeye odaklanan kanser dışı araştırmacılar için de çok faydalı olabilir.

Bu protokol, hücre genomunda histon modifikasyonlarının ve çeşitli proteinlerin yerinde kalan profillerinin haritalanmasına olanak tanır. SCLC alt tipleri arasında histon PTM'ler ve TF bağlanmasının sağlanması, alt tipe özgü hedeflenebilir genleri ve düzenleyici unsurları, örneğin güçlendiriciler ve süper-artırıcılar ortaya çıkarabilir.