Nijmegen Hemostaz Testi: Tek bir Kuyiyada Trombin ve Plazmin Üretiminin Eşzamanlı Florojenik Ölçümü

Araştırmam, ikincil hemostaz ve fibrinolizi birlikte ölçerek genel hemostatik dengeyi ölçmeye odaklanıyor. Mevcut testlerin çoğu, pıhtılaşma veya fibrinolizin izole bileşenlerini değerlendirir. Bu test, her iki süreci aynı anda tek bir testte ölçer.

Başlamak için, floresans plaka okuyucuyu açın ve 37 derece Celsius olarak dengelenmesini sağlayın. Yazılımda filtre ayarlarını dalga boyu çiftlerinin sayısını ikiye ayarlayarak ayarlayın. Uyarılma dalga boyunu trombin için 355 nanometre, plazmin için 485 nanometreye ayarlayın.

Sonra emisyon dalga boyunu trombin için 460 nanometre, plazmin için ise 525 nanometre olarak ayarlayın. Sonra, Plaka Tipini 96 Well Greiner Flat Bottom Black mikroplakasına ayarlayın. Okuma Alanı'na gidin ve plaka düzenini her plaka başına maksimum 20 kuyu kullanarak tanımlayın.

PMT ve optik ayarlarını PMT Kazancını 200 volta, okuma başına Flaş sayısını ise altı olarak ayarlayarak ayarlayın. Sonra Zamanlama Ayarlarını doğrulamak için Zamanlama bölümüne geçin; toplam çalışma süresi bir saat dokuz dakika 30 saniye, yani 30 saniyelik bir aralık. İlk okumadan üç saniye önce bir sallanma doğrulamak için Shake sayfasına geçin.

Okuma Sırası'nın Column olarak ayarlandığından emin olmak için Daha Fazla Ayarlar'a gidin. Bileşik Transferi Okumadan Önce ayarlarını bir ve Başlangıç Hacmini 120 mikrolitre ayarlayarak yapılandırmak. Pipet yüksekliğinin 130 mikrolitre, hacmin 20 mikrolitre, hızın saniyede bir mikrolitre ve zaman noktasının 14 saniye olduğundan emin olun.

Compound Source altında, 96 Well Compound Plate formatını onaylayın ve özellikle Beckman 96 2.3 mililitre seçeneğini seçin. Doğru sütunları seçerek Pipet Uçları Düzeni ayarlarını doğrulayın. Şimdi Bileşik Uçlar Sütunları'na gidin ve doğru sütunları seçin.

Mikroplaka çalkalayıcı sıcaklığını 37 derece Celsius'a ayarlayın ve kullanmadan önce sıcaklığı doğrulayın. Sonra sarsıntı yoğunluğunu dakikada 1.100 devire ayarlayın. Sonra hasta plazması ve normal birikmiş plazma 37 derece Santi-Celsius su banyosunda 10 dakikaya kadar çözülür.

Plazma örneklerini iyice karıştırın ve görünür kriyopresipitat olmadan tam erimeyi doğrulayın. Bir pipet kullanarak, önceden seçilmiş kuyulara 80 mikrolitre hasta plazması veya normal biriktirilmiş plazma ekleyin; her örnek için taze bir pipet ucu kullanılır. Sonra 48 mikrolitre sefalin ile 48 mikrolitre doku faktörü karıştırarak substrat karışımını hazırlayın.

Buna 240 mikrolitre trisodyum klorür tamponu ekleyin, ardından 96 mikrolitre trombin substratı ve 48 mikrolitre plazmin substratı pipet ekleyin. Her kuyuya 20 mikrolitre substrat karışımı pipet yapın. Sonra salla.

Şimdi mikroplakayı floresan plaka okuyucuya yerleştirin ve birkaç dakika boyunca 37 derece Celsius'ta dengelenmesine izin verin. Başlangıç reaktifini hazırlamak için trisodyum klorür tamponu, trisodyum klorür kalsiyum klorür tamponu ve doku plazminogen aktivatörünü birleştirin. Vortex iyice karıştırmak için.

Başlangıç reaktif karışımını bileşik kolonunun tüm sıralarında pipetleyin. Başlangıç reaktif karışımını içeren plakayı kaynak çekmecesine yerleştirin ve floresan ölçümüne başlayın. Her 30 saniyede bir 70 dakika boyunca floresan sinyallerini kaydedin.

Ölçüm boyunca plakayı 37 derece Celsius sıcaklığında tutun. Veri analizi için, kinetik floresans verilerini kuyu başına zaman noktaları ve floresan değerlerini içeren bir tablo olarak dışa aktarın. İlk türevi hesaplayın ve her kuyu için enzim üretim eğrilerini çizerek trombin veya plazmin oluşumunu zaman içinde görselleştirin.

Hemostaz testi, trombin ve plazmin üretiminin eşzamanlı ve zaman çalınımlı ölçümlerini mümkün kılarak pıhtılaşma ve fibrinolizi entegre bir değerlendirme sağladı. Trombin üretim eğrisinden gecikme süresi, tepe yüksekliği ve trombin potansiyeli gibi birkaç parametre türetilebilir. Daha uzun gecikme, daha düşük zirve yükseklikleri ve azalmış trombin potansiyelleri, trombin üretiminin bozulduğunu gösterir.

Plazmin üretim eğrisi ayrıca fibrin lizis süresi ve plazmin zirve yüksekliği dahil olmak üzere birden fazla parametre sağlar. Daha kısa fibrin lizisi süreleri ve daha yüksek zirve yükseklikleri, plazma üretiminin arttığını gösterir. Üç sağlıklı kontrol ve normal havuzlanmış plazmadan elde edilen trombin ve plazma üretim eğrileri, tekrarlanabilir zirve yüksekliği son zamanlamalarını gösterdi ve normal hemostatik fonksiyon için referans profilleri olarak hizmet verdi.

Faktör V aktivitesi %3 olan bir hastada trombin üretimi tamamen yoktu. Ancak, plazma üretimi biraz arttı. Faktör V aktivitesi %44 olan hastada trombin oluşumu azaldı, uzun gecikme süresi ve zirve yükseklik azaldı, plazma üretimi normal aralıkta kaldı.

Alfa-2-antiplazmin eksikliğinde, Alfa-2-antiplazmin aktivitesinin azalmasıyla birlikte plazma üretimi arttı. %23 aktiviteye sahip homozigot hastada erken bir plazmin oluşumu başladı, fibrin lizisi süresi daha kısa ve plazma zirvesi daha yüksekti. Bu değişiklikler, %73 aktivite oranına sahip heterozigot hastada da gözlemlendi, ancak o kadar belirgin değildi.

Hemostaz testi, nadir pıhtılaşma faktörü eksiklikleri, fibrinolitik bozukluklar ve hemostatik ilaç etkileri üzerine araştırmalar için oldukça uygundur. Ana zorluklar, tekniğin standartlaştırılması ve sonuçların normalleştirilerek odalar ve laboratuvarlar arasında karşılaştırılabilirliği artırmaktır. Gelecekteki çalışmalar, testi otomatikleştirmeye ve tam kan veya plakalı plazma ile uyumluluk için uyumlar geliştirmeye odaklanabilir.