Fare Radyal Kırıkları İçin Yeni Bir Dahili Fiksasyon Modelinin Geliştirilmesi: Kırık İyileşme Değerlendirmesi ve Dorsal Kök Ganglion İzolasyonu

Radyal kırıklar dünya genelinde oldukça yaygındır ve uzuv uzun kemik kırıklarının başlıca nedenlerinden biridir. Fare radyal kırık modeli, ortopedi araştırmalarında kırık iyileşmesi, ilaç taraması ve biyomateryal değerlendirmesini incelemek için kritik öneme sahiptir. Sıçanların yarıçapı nispeten ince olduğundan, klinik uygulamada şu anda kullanılan çelik plakalar ve vidalar sıçan radyal kırıklarının tedavisinde uygun değildir.

Bu sınırlamayı aşmak için protokol, dikiş ve titanyum iğne fiksasyonunu yenilikçi bir şekilde birleştirerek iç fiksasyon araştırmaları için stabil bir radyal kırık modeli oluşturuyor. Protokolde, farelerde kırık iyileşmesini netleştirmek için canlı hayvan mikro-BT görüntüleme sisteminin kullanımını da sunduk. Ayrıca, fare kırık modelinde DRG'nin ekstraksiyonu ve kültürünü gösterdik; bu model, kırıklarda sinir hasarı ve onarım mekanizmalarını incelemek için kullanılacaktır.

Fare kırığı cerrahi aletleri arasında bistür, bistüri sapı, ameliyat makası, iğne tutucu, hemostatik forseps ve dişli doku forseps bulunur. Erkek Sprague Dawley sıçanı yaklaşık 8 haftalık, yaklaşık 200 gram ağırlığında. Sıçanı izofloran gazı anestezi makinesiyle anestezi yapın ve cerrahi işlem boyunca ventilyator anestezi uygulanmasını sürdürün.

Ameliyathane sıcaklığını 28 C'de tutun. Fareyi yan pozisyona yerleştirin. Sağ ön uzuvu açığa çıkar ve saç makası ile saçları tıraş et. Steril çarşaf örtün ve cerrahi kanamayı azaltmak için proksimal sağ ön uzuvun etrafına turnike sar.

Cildi alkol ve betadin peelinglerini üç kez dönüşümlü olarak hazırlayın. Sağ ön kolun dorsal radyal tarafında 1,5 cm boyuna bir kesi yapın. Kas boşluklarını ayırın ve sağ ön uzuv yarıçapını tamamen açığa çıkarın.

Enine bir çatlak oluşturmak için yarıçapı kesmek için ameliyat makası kullanın. Makasın yönü yarıçapla 90 derece açı oluşturur. 0,8 mm çapında, 10 mm uzunluğunda bir titanyum iğne alın ve boyuna eksen boyunca radyal çatığa yerleştirin.

Radiusu ve titanyum iğnesini dikişle sabitleyin. Dikiş ardışık üç düğümle bağlandı ve titanyum iğne dört kesintili dikişle yarıçapa sabitlendi. Fazla dikişin ten rengini dikin ve ahşabı kapatın.

Deriyi betadin peelingleriyle dezenfekte edin. Yarayı steril gazlı bezle kapatın ve bandajlarla sabitleyin. Fare anestezi sonrası bilincini kazandı ve durumu iyi iyileşti.

Sıçan, izofloran gazı anestezi makinesiyle anestezi yapın. Fareyi tarama odasında yatağa yerleştirin. Hedef tarama alanını görüş alanında merkeze yerleştirecek şekilde uzuv ve baş pozisyonunu ayarlayın ve işlem boyunca sürekli ventilasyon ve anestezi sürdürün.

Sabit hayvan yatağını tarama odasına itin ve odanın kapısını kapatın. Mikro-BT tarama parametreleri şu şekilde ayarlandı: tarama modu: standart, pozlama süresi: iki dakika, görüş alanı: 72 mm, voxel boyutu: 144 m, kilovolt: 90; mikro amperler:88, filtre:3D-yumuşak. Tarama verileri otomatik olarak yazılıma iletilir ve üç boyutlu CT görüntüsü oluşturulur.

Hedef dokuları ayırın. İşlenen görüntüleri dışa aktarın. Omurgayı kesin, C1'den C7'ye kadar olan omurga gövdelerini çıkarın.

Servikal omurga, sol ve sağ yarıya ayrılan ön ve arka orta hatlar boyunca kesil. DRG'yi almak için dişli doku forsepsiyle alın, nazikçe kaldırın ve ardından ameliyat makası ile sinir liflerini kesin. Ekstraksiyon yapılan DRG'leri ekstraksiyon ortamıyla birlikte 1.5 mL santrifüj tüpüne aktarın.

Buz üzerine koyun. Ekstraksiyon ortamını yavaşça aspire edin ve atın. 1 mL karışık sindirim ve enzim çalışan çözelti ekleyin.

37 C'lik su banyosunda 60 ila 70 dakika sindirin. Uygun miktarda fibronektin çalışma çözeltisini bir Petri kabına pipet yapın ve 37 C kuluçka makinesinde bir saat boyunca kaplayın. Sindirimden sonra karışık sindirim enzimi çalışan çözümünü aspire edin ve atın.

Filtrat toplayın, 70 x g ile 8,5 dakika boyunca santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı santrifüj tüpündeki aspirasyon ve atma işlemi yapılır. Çökeltiyi yeniden süslemek için 1 mL tam ortam ekleyin.

Petri kabını çıkar. Fibronektin çalışan çözeltiyi atın ve PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri bir Petri kabına aşılayın, 1 mL tam ortam ekleyin.

Onları %5 karbondioksit ile 37 C'de sabit sıcaklıkta 8-12 saat boyunca koyun. Mikro-BT görüntüleme, radyal kırık fare modelleri ve fare radyal kırıkları için iç fiksasyon modelinin başarıyla kurulduğunu doğruladı. Modellemeden 20 gün sonra, kırığın model grubundaki SD sıçanların mikro-BT analizi olumlu prognoz gösterdi.

Kırık uçlarını kapatan kallus oluşumu, ilerleyici bir füzyon ve kemik birleşmesinin erken evresi ile tutarlı olan kırılma hattının kademeli obliterasyonu gözlemlenmiştir. Görüntüler, modellenen bölgede bulanık bir kırık çizgisi gösterdi ve bu da çatlak bölgesindeki kemik dokusunun büyük ölçüde iyileştiğini gösteriyor. DRG izolasyonundan sonraki 5-6. günlerde, nöronal hücreler yoğun sitoplazmik maruziyet gösterir.

Bu aşamada, tüm nöronal hücre gövdeleri ve çevresindeki sinapslar açıkça ayırt edilebilir. Kültürün 6. gününde nöronal hücrelerin fotoğraflanması için immünofluoresans mikroskopisi kullanıldı. Şekil 9'da gösterildiği gibi, Beta III-tubulin yeşil floresans olarak gösterilmiştir.

DRG hücre gövdeleri ve aksonları içeren beta III-tubulin pozitif hücreler yeşile boyanmış ve mavi floresans DAPI ile boyanmış nöronların çekirdeklerini temsil etmektedir. Fareler, net genetik geçmişleri ve kısa üreme döngüleri nedeniyle kırık iyileşme mekanizmasını incelemek için klasik bir modeldir. Ancak, yaklaşık 1-1,5 mm büyüklüğündeki küçük yarıçaplı çap, klinik seviyede iç fiksasyon cihazına uydurmayı imkansız kılar ve bu da sinir kemiği iyileşme araştırmalarında faydasını ciddi şekilde kaçırır.

Bu soruna yanıt olarak, bu çalışma yenilikçi bir şekilde kombine dikiş titanyum iğnesi iç fiksasyon yöntemini önerdi. Temel mantık, vidaların sert fiksasyonunu esnek dikiş bağlanmasıyla değiştirmektir; bu da iatrojenik sinir yaralanmasını azaltabilir ve stabil mekanik ortam sağlayabilir. Bu protokol, modelin inşası için tekrarlanabilirlik ve standartlaştırma sağladı.

Dikişler ve titanyum iğneleri, fare radyal kırık modellerinde iç fiksasyon için kullanılır. Kırık iyileşmesi mikro-BT ile değerlendirilir. Birincil DRG nöronları kırık iyileşme muayenelerinden sonra izole edilip kültürlenmektedir.

Protokolde, sıçan radyal kırık modelinde stabil iç fiksasyon için dikişler ve titanyum iğneleri yenilikçi bir şekilde birleştiriyoruz. Kırık iyileşmesi mikro-BT ile değerlendirildi ve primer DRG nöronları izole edilip daha ileri inceleme için kültürlendi.