CAR T Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Ekranlarının İyileştirmesi: Kütüphane Hazırlığı için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Araştırmamız, hedefleri belirlemek ve CAR T hücre tedavilerinin etkinliğini artırmak için CRISPR tarama yaklaşımlarını kullanmaya odaklanmaktadır. Mevcut deney zorlukları arasında CRISPR tarama yaklaşımlarında tekrarlanabilir laboratuvar yöntemlerinin elde edilmesi yer almaktadır. Başlamak için, T hücreleri içeren 24 kuyu plakaya önceden belirlenmiş miktarda Lenta viral CRISPR kütüphanesi ekleyin.

Poli beyin son konsantrasyonda mililitrede sekiz mikrogram konsantrasyonda ekleyin. Dengeli dağılım için nazikçe karıştırın. Hücreleri 700 G'de 90 dakika boyunca 32 derece Celsius'ta santrifüj ederek spin-feksiyon yapılacaktır.

Santrifüjlemeden sonra plakayı dikkatlice santrifügeden çıkarın. Medyayı taze T-hücresi büyüme ortamıyla değiştirin. Altı saat sonra, üç enfeksiyon sayısında CAR lenta viral vektörünü ekleyin.

Hücreleri dört gün boyunca 37 derece Celsius sıcaklıkta kuluçka edin. Kuluçka tamamlandıktan sonra CAR T hücrelerini toplayın. PBS ile bir kez yıkayın.

Sonra hücreleri akradin turuncu propidyum iyodid ile boyayıp floresan hücre sayacı ile sayın. Elektroporasyon tamponunda dört mikromolar Cas9 çözeltisi hazırlayın. Beş kat 10 güç, altı CAR T hücresini 50 mikrolitre cas9 çözeltisine yeniden süsleyin.

Sonra hücre süspansiyonundan 50 mikrolitreyi çok kuyuklu bir kuvete şeridinin her kuyusuna pipotleyin, kabarcık oluşturmadan. Görünür kabarcıkları pipet ucunu nazikçe kuyunun kenarları boyunca geçirerek çıkarın. CAR T hücrelerini nükleofekt etmek için genişletme T-hücresi üç programını kullanın.

Küvetleri 37 derece Celsius'ta 40 dakika boyunca kuluçka makinesine yerleştirin. Çekirdeklenmiş hücreleri T-hücresi büyüme ortamında yeniden süzülür. Sonra tekrar 37 derece Celsius'ta üç gün boyunca kuluçka yapın.

Hücreleri, floresan hücre sayacında akradin turuncu propidyum iyodid boyaması kullanarak sayın. Hücre yoğunluğunu mililitrede altı hücre gücüne on kadar ayarladıktan sonra, puromisin son konsantrasyona 2,5 mikrogram/mililitre eklenir. Altı günlük kuluçkadan sonra, akış sitometrisi kullanarak CAR pozitif hücrelerin yüzdesini değerlendirin.

Sonra CAR T hücre popülasyonlarını ayırın ve kuru hücre pelletlerini -80 derece Celsius'ta depolayın. Hücreler ve doku DNA çıkarma yöntemiyle örneklerden genomik DNA çıkartın. Genomik DNA konsantrasyonu çift zincirli DNA nicelendirme kiti kullanılarak ölçün.

Sonrasında toplam 50 mikrolitre hacimde 20 birim seçilmiş krestriksiyon enzimiyle beş mikrograma kadar genomik DNA sindirin. Bir termosiklerde gece boyunca 37 derece Celsius'ta kuluçka yapın. Ertesi gün, 10 mililitre elülasyon tamponu içeren 10 mililitre HCL ve 50 mililitre taze %70 etanol hazırlayın.

Sindirilmiş ürünü 100 mikrolitre boynuk içeren bir tüpe şeklinde pipetleyin. Süspansiyonu iyice karıştırmak için pipet yapın ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçka geçirin, ardından beş dakika daha manyetize edin. Mıknatıs üzerindeyken süpernatantı atıp %70 etanol çözeltisi 200 mikrolitre pipetle atışı yaparak pelleti rahatsız etmeden kullanın.

30 saniye sonra, süpernatantı atın ve iki alkol yıkaması daha yapın. İki yıkamadan sonra, boncukları iki dakika kurutmaya bırakın, ardından mıknatıstan çıkarın. 40 mikrolitre elucian tamponu ve pipet ekleyin, boncukları tekrar askıya alın.

Süspansiyonu iki dakika mıknatıslaştırın, ardından süspansiyonu yeni bir tüpe aktarın. Bir miligram vortex streptavidin manyetik boncuk içeren bir tüpe bir x yıkama bağlama tamponu ekleyin. Pipette ile tampon içindeki boncukları tekrar asmak için.

Sonra süspansiyonu bir mıknatısın üzerine bir dakika koyun, süspansiyonu atın ve iki yıkama daha yapın. Üçüncü yıkamadan sonra boncukları iki x yıkama bağlama tamponuna yeniden yerleştirin. Sonra saflaştırılmış sindirim ürününe beş mikrolitre 10 mikromolar biyotinilasyonlu pull down primer ekleyin.

Karışımı 96 derece Celsius'ta kuru bir banyoda beş dakika kuluçka yapın ve hemen buzun üzerinde beş dakika soğutun. Reaksiyona bir miligram önceden yıkanmış, streptavidin manyetik boncukları ekleyin, böylece hem reaksiyonun hem de streptavidin boncuklarının eşit hacimli olmasını sağlar. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın ve her dört dakikada bir tekrar süzülür.

Boncukları beş dakika mıknatısla yapın, ardından bir x yıkama bağlama tamponu ile üç kez yıkayın. Son olarak, bağlı sgRNA kaseti içeren boncukları 50 mikrolitre elucian tampon içinde yeniden askıya alın. SgRNA kütüphanesini hazırlayıp güçlendirin ve dizileyin.

Antibiyotik seçiminin ardından, CRISPR kütüphanesiyle transdüksiyon yapılan CAR T hücreleri, puromisin tedavisinden sonra her iki donörde de hayatta kalma ve proliferasyonun devam ettiğini gösterdi. Transdüksiyon yapılmamış T hücresi ve CRISPR kütüphanesi transdüksiyonu olmayan CAR T hücreleri, antibiyotik seçimi altında benzer proliferasyon göstermedi ve negatif kontrol olarak hizmet verdi. NDEL ve PSPXI ile restriksiyon enzim sindirimi, zenginleştirme için tek rehber RNA kasetini koruyarak parçalanmış genomik DNA üretti.

SgRNA içeren parçalar daha sonra seçici olarak amplifikasyon yapıldı. Pearson ve Spearman korelasyonları, donör genomik DNA örneklerinde plazmid kütüphanesine kıyasla tek rehber RNA okuma sayılarının ve kütüphane karmaşıklığının korunduğunu gösterdi. Sağlam sıralama toplama analizi, her iki donörde Cas9 düzenlemesinden sonra önemli ölçüde zenginleşen veya tükenmiş genleri tespit etti.

Yol zenginleştirme analizi, tanımlanan genetik düzenleyicilerle ilişkili en önemli gen ontolojisi terimlerini ortaya çıkardı. Protokolümüz, CRISPR tarama yöntemleriyle mevcut laboratuvar tekniklerine güvenilir bir alternatif sunmaktadır. Bulgularımız, daha tekrarlanabilir ve sağlam CRISPR tarama protokollerinin geliştirilmesini destekleyerek alanı ilerletecek.

Sonuçlarımız genlerin tanımlanmasının yolunu açtı ve CAR T hücresi fenotipi ve fonksiyonunu geliştirmek için moderatörlük edilebilir.