Yaşlanma Belirteçlerinin Mekansal Değerlendirmesi İçin Multipleksli İmmünoflüoresans Testi
24 Temmuz 2026
Çoklu immünoflüoresans, doku mimarisi ve hücre popülasyonlarının mekansal analizini desteklemek için tek bir doku bölümünde birden fazla antikor belirteçinin ardışık olarak etiketlenmesini sağlar. Burada, yaşlanma ile ilişkili, yapısal ve bağışıklık belirteçlerinin çoklu algılanması için manuel ve otomatik slayt hazırlığı, yinelemeli görüntüleme ve dijital patoloji yazılımı kullanılarak tek hücre analizi dahil olmak üzere bir iş akışı sunulmaktadır.
Yaşlanan hücrelerin mekânsal analizi, yaşlanma, kanser, bağışıklık ve normal doku homeostazı gibi süreçlere katkılarını anlamak için önemlidir. Yaşlanan hücrelerin tespiti, birden fazla biyobelirteçin profillenmesine dayanır. Çoklu immünoflüoresans görüntüleme, bu cihazların tek bir doku bölümü içinde yüksek verimlilik profilini mümkün kılar.
Başlangıç olarak, maksimum 4 x 2 santimetre kare boyutta olan 5 mikrometre kalınlığında formalin sabitli, parafinle gömülü veya FFPE doku kesitlerinin pozitif yüklü mikroskopi slaytlara merkezi olarak monte edildiğini ve kapaksız slayt tutucusunun izleme penceresinde net göründüğünü doğrulayın. Numune hazırlama adımlarını, ya manuel olarak bir gizleme odası kullanarak ya da otomatik bir boyama cihazı kullanarak gerçekleştirin. Hazırlanan sürgüleri kapalı sürgü tutucuya yerleştirin.
Üst ve sağ kenarları metal duruculara hizalayın. Plastik kamları kapalı asma kilit pozisyonuna getirmek için sürgü aynı anda iki elinizle kilitleyin. Sürgü tamamen düz oturduğundan ve tutucu içinde sallanmadığından emin olun.
ClickWell'i yerleştirin, bölmeyi sürgü üzerine yerleştirin ve basıncı sınırlamak ve kırılmaları önlemek için yan çubukları iki elinizle sıkın. Tıklama yuvasına, giriş portundan %50 gliserol içeren ve fosfatla tamponlanmış tuzlu salin içeren 2 mililitre montaj ortamı yükleyin. Slaytın sol tarafına herhangi bir yönde bir barkod etiketi ekleyin, ardından görüntülemeye geçin.
Bölge seçimi ve otofloresan analizi için, Mx Workflow versiyon 4204, çoklu görüntüleme alma yazılımını açın. Protokol Yayıncısı seçmek için Araçlar'a tıklayın. Multiplex Protocol Publisher açılır penceresinde protokol adını girin.
Create Setup Round'a tıklayın, ardından Next Protocol Round'u ekle birden fazla biomarker etiketleme turu oluşturun. Yayınla'na tıklayın, ardından açılır pencereden OK seçin. Sanal H&E görüntüleri için Cy3 kanalını edinin.
Slide'a tıklayın, sonra Yeni Parti Oluştur. Protokol adını seçtikten sonra slayt ID'sini girin. Add Slide'a tıklayın ve ardından çoklu deney iş akışı oluşturmak için Toplu Oluştur'u seçin. Cell DIVE satın alma yazılımını açın.
Mikroskopa slaytı yüklemek için Load tuşuna tıklayın. Araçlar açılır menüsünde, istenen bölgeleri tanımlamak için ızgara simgesine tıklayın ve tanımlanan bölgeleri yeniden konumlandırmak için Move aracını kullanın. Sonra, Çizim aracını kullanarak gereksiz olan alanları seçimden kaldırın; böylece her görüş alanının en az iki bitişik görüş alanı olduğundan emin olun ve Bölgeleri Kaydet'e tıklayın.
Mx Workflow penceresinde, Cell DIVE görüntüleyici sayfasını açmak için Viewer QC'ye tıklayın ve doku görüntüsünü 10x büyütme ile görselleştirin. Görüntü düzeltme simgesine tıklayarak görüntü parlaklığını ayarlayın ve açılır pencerede Pass and Reload Slide'ı seçmek için Submit QC tuşuna tıklayın. Görüntü yeniden yüklendiğinde, İlgilendiğiniz bölgeleri çizmek ve ayarlamak için Yatırım Getiri Ekle seçeneğine tıklayın.
İstediğiniz görüş alanlarını seçin ve ROI eklemesini tekrarlayın. Sonra, Laboratuvara Gönder düğmesine tıklayın. Slaytı yükleyerek 20x otofloresan görüntü alımı başlatın.
Görüntüleme kalite kontrol menüsünde, belirli Slayt Kimliği'ne karşılık gelen kontrol kutusunu seçin, ardından Görüntüleyici QC'ye tıklayın. Yüklenen görüntüye yakınlaştırarak odak dışı bölgeler veya artefaktlar için tara. Her kanalın arka plan görüntülerini kontrol edin; bu görüntüler nihai biyomarker sinyalinden çıkarılacaktır. Kalite Kalitesi Gönder'e tıklayın, ardından Pass ve Exit seçeneklerini seçerek arka plan görüntüleri oluşturun.
Sıralı biyomarker boyamadan önce, antikorları oda sıcaklığında 13.000 G boyunca bir dakika boyunca santrifüjlenerek artefaktları sınırlandırın. Antikor çözeltisi, %0,3 sığır serum albümini (BSA) içeren fosfatlı tamponlu tuzlu salin (PBS) içinde 1'de 200 seyreltme ile hazırlayın. Montaj ortamını ClickWell portundan pipet yaparak çıkarın.
Ve 5 dakika boyunca 0.01%Tween 20 veya PBST içeren 2 mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Boyama odasında tam numune kaplamasını sağlamak için porta 350 mikrolitre antikor çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat kuluçka yapın.
Sonra, ClickWell portundan antikor çözeltisini pipetleyin. Ve 2 mililitre PBST ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. 2 mililitre montaj ortamı ekleyin.
ClickWell tutucusunu mikroskopa yerleştirin ve slaytı yükleyerek 20x biyomarker görüntülemeye başlayın. Blend editörü ve görüntü düzeltme seçenekleriyle görüntüleme kalite kontrolünü yapın ve görüntü kalite kontrol değerlendirmesini gönderin. ClickWell portundan montaj medyasını pipetleyin ve 2 mililitre PBST ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
Boyayı inaktivasyon çözme çözümünü kullanımdan önce taze hazırlayın. PBST çıkarıldıktan sonra, her slayt için 2 mililitre boya inaktivasyon çözeltisi ekleyin. Slayt tutucuda 15 dakika kuluçka yapın.
ClickWell portundan boya inaktivasyon çözeltisini pipetle çıkarın ve 2 mililitre PBST ile 5 dakika boyunca yıkayın. 2 mililitre montaj ortamı ekleyin ve ClickWell tutucusunu mikroskopa yerleştirerek otomatik tur spesifik 20x otofloresan görüntüleme başlatın. İş akışını ilerletmek için ekranda gösterilen kalite kontrol önlemleri adımlarını geçirin.
Ardışık boyama, boya inaktivasyonu ve çoklu görüntüleme işlemlerini gerektiği kadar çok işaretleyici için tekrarlayın ve tamamlanana kadar devam edin. HALO yazılımını kullanarak doku çekirdeğinin farklı bölgelerindeki işaretleyicilerin lokalizasyonunu görselleştirmek için çeşitli kanalları seçin. Analiz et'e tıklayın ve Tamam Görseli seçin; bireysel belirteçler için nicel metrikleri analiz edin.
Analiz edilen doku çekirdeğindeki toplam hücre sayısını ve belirli belirteçleri ifade eden hücrelerin alt kümesini görmek için Sonuçlar'a tıklayın. Otomatik kaydırma boyama tabanlı yönteme kıyasla, manuel decloaking odası tabanlı yöntem, özellikle doku ayrılması ile kaybedilen veya kaymış çekirdeklerle karakterize edilen doku artefaktlarının daha yüksek sıklığını sağladı. Dijital patoloji yazılımıyla temsil pankreas dokusu üzerinde yapılan niceliklendirme, p16 pozitif hücrelerin daha düşük LB1 seviyeleriyle ilişkili olduğunu ve bunun da tam tersinin olduğunu ortaya koydu ve bu da yaşlanmaya bağlı belirteç kalıplarıyla uyumlu bir profil gösterdi.
Z-skoru normalize edilmiş bir ısı haritası, p16 pozitif lamin-B1 negatif yaşlanma fenotipinin çeşitli dokular arasında dağılımını gösterir ve akciğer, adrenal ve hipofiz bezlerinde yüksek p16 ve azalmış LB1 seviyelerine karşılık gelen yüksek yaşlanmış hücre konsantrasyonlarını ortaya koyar. Buna karşılık, apandistik, lenf düğümü ve dalak düşük yaşlanma göstererek yüksek LB1 ve düşük p16 ekspresyonunu korudu. Bu protokol, yaşlanma, yapısal ve bağışıklık biyobelirteçlerinin kombinasyonunun tek bir mikroskopi slaytında incelenmesine olanak tanır.
Birden fazla belirteçin tek bir örnek içinde birleştirilmesiyle doku mimarisi ve yaşlanan hücre dağılımı mekansal analizi yapılabilir. Gelecekteki uygulamalar arasında, birden fazla doku tipi boyunca yaşlanma biyobelirteçlerinin büyük ölçekli profillenmesi ve hücresel heterojenliği daha iyi çözmek için mekânsal omiklerle entegrasyon yer almaktadır.
Overview
This article presents a comprehensive protocol for multiplexed immunofluorescence (IF) staining, enabling the simultaneous detection of multiple antibody markers within a single tissue section. The method is particularly suited for profiling senescent cells across diverse human tissue types, allowing for detailed spatial and quantitative analysis that surpasses traditional IF techniques.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular senescence
- Immunofluorescence imaging
- Digital pathology
- Tissue microarray analysis
Background
- Traditional IF imaging is limited in the number of markers that can be assessed simultaneously.
- Senescence lacks a universal biomarker; signatures vary by cell type, trigger, and time since induction.
- Multiplexed IF allows for the detection of multiple markers in a single tissue section, improving cell type and structure profiling.
- Spatial relationships between cell types and tissue structures are critical for understanding senescence in situ.
Purpose of Study
- To provide a detailed protocol for multiplexed IF staining and imaging of human tissue samples.
- To enable unbiased detection and spatial analysis of senescent cells using combinatorial biomarker approaches.
- To demonstrate the utility of multiplexed imaging for comprehensive tissue profiling.
Methods Used
- Tissue microarrays from 34 human tissue types were utilized.
- 10-plex immunofluorescence staining targeting structural, immune, and senescence biomarkers.
- Sequential staining, imaging, and dye inactivation cycles to build multiplex datasets.
- Image acquisition with a multiplex fluorescence slide scanner.
- Protocols for both manual and automated slide preparation.
- Single-cell segmentation and spatial analysis using digital pathology software.
Main Results
- Successful multiplexed detection of multiple biomarkers within single tissue sections.
- Assessment of abundance and spatial distribution of senescent cells across diverse tissues.
- Generation of high-content multiplex datasets suitable for advanced spatial analysis.
- Protocols adaptable for both manual and automated workflows.
Conclusions
- Multiplexed IF provides a powerful, unbiased approach for senescent cell detection in situ.
- The described methods facilitate comprehensive spatial and quantitative analysis of tissue samples.
- This protocol serves as a general guide for multiplexed imaging in research and pathology applications.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Multiplexed immunofluorescence enables high-content spatial profiling of senescence markers across diverse human tissues, addressing the challenge of heterogeneous senescence signatures in drug discovery. This approach enhances predictive confidence in target validation and supports translational continuity by allowing simultaneous assessment of multiple biomarkers within a single tissue section. The method is positioned to improve decision-making at key inflection points in early discovery and preclinical research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of senescence-associated pathways using combinatorial biomarker panels.
- Supports biological de-risking by revealing cell-type and context-specific senescence signatures.
- Facilitates predictive confidence in target selection through spatially resolved marker analysis.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue systems for downstream screening of senescence-modulating compounds.
- Standardizes multiplexed assay workflows for reproducible and quantitative biomarker detection.
- Enables scalable imaging and analysis suitable for high-throughput tissue microarray studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial biomarker data with disease-relevant tissue contexts for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by supporting unbiased senescent cell detection.
- De-risks advancement decisions by quantifying abundance and distribution of senescent cells in situ.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplexed IF assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling spatially resolved, quantitative analysis of senescence markers in human tissue microarrays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through multi-marker spatial profiling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in validated tissue contexts.
- Analytics: Provides high-content imaging datasets and digital pathology outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by aligning biomarker data with disease-relevant tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for multiplexed imaging across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in senescence research.
- Operational Value: Standardizes multiplexed imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust spatial biomarker analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of senescence-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiplexed immunofluorescence and digital pathology analysis.
- Needs access to multiplex slide scanners and compatible digital pathology software.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and analysis protocols.
- Adaptable to both manual and automated slide preparation workflows.
- Dependent on tissue quality and marker panel optimization for reliable outputs.
