Fare Kortikal Dokusundan Perisitlerin Tek Hücreli Dizileme için FACS Kullanılarak İzolasyonu

Araştırmamız, beyin parazitlerini damar rollerine ve nörovastar ünite içindeki etkileşimlerine odaklanarak inceleyerek beyin fonksiyonunu anlamaktadır. Düşük görüntüleme ve bir bağırsak sürecinde mekansal FACS, beyin damarlarında parazit fonksiyonu haritalanması veya konumun, spesifik rollerin ve terapötik hedeflerin ortaya koyulmasıydı. Başlamak için, ötenazi yapılan bir farenin baş ve boyun bölgesine %75 etanol püskürtün.

Bir nestik kullanarak, oksipitalden frontal bölgeye orta hat saç derisi kesisi yapın ve kafatası ortaya çıkarılır. İki taraflı orbitaların önünde enine kesi yapılması ve ardından beyincik alt kenarları boyunca yan kesiler yapılarak kafatası tabanını ayırmak. Kalvariumu sagital dikiş boyunca arkadan öne doğru uzunlamasına kesin.

Kafatası kapağını duramater ile birlikte kaldırarak beyni açığa çıkarın. Cerrahi makas kullanarak, optik sinirleri ve medulla oblongata omurilik bağlantısını koparırken beyni nazikçe yükseltin. Sağlam beyni, 10 mililitre buz gibi soğuk PBS içeren 10 santimetrelik bir kaba nazikçe yerleştirin, böylece zarar görebilirsiniz.

Beyni alüminyum folyoya aktarın. Subaraknoid boşluğu açığa çıkar. Durayı penssle çıkardıktan sonra, Hank'in dengeli tuz çözeltisiyle durulayın.

Mendiliyi filtre kağıdına aktarın ve piamateri rulo ile çıkarın. Jilet ile koku soğanını ve en fazla kuyruk bölümünü kesip at, beyni koronal olarak iki ila üç milimetre kalınlığında dilimlere ayırın. Beyin korteksini korpus kallosum boyunca izole edin.

Kortikal dokuyu üç mililitre buz soğuğu dokusu toplama tamponu içeren ampullere aktarın. Cerrahi skarpeller kullanılarak, doku ve ampülleri yaklaşık birer milimetrelik parçalara doğrayın ve doku tazeliğini korumak için beş dakika içinde doğranmayı tamamlayın. Pipet uçlarını doku toplama tamponuyla önceden durulayın.

Sonra kıyılmış parçaları yavaşça ucuna doğru aspire ederek pipeti dikey tutun. Parçaları önceden soğutulmuş 15 mililitrelik santrifüj tüplerine nazikçe fırlatın. Orijinal ampülleri PBS salininde %2 FBS ile yıkayın.

Yıkamayı aynı santrifüj tüplerine aktarın ve 300G'de dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra süpernatantı atın. Her peleti üç mililitrelik CD enzim çalışan çözelti içinde yeniden askıya alın.

Süspansiyonu eşit olarak üç tüpe ayırın ve ek enzim çözeltisi ekleyerek tüp başına beş mililitre nihai hacme ulaşın. Tüpleri hibritizasyon fırınında 37 derece Celsius'ta 100 dakika boyunca kuluçka edin, 100G yörüngesel sallama ile kullanın. İnkubasyon sırasında, PBS'deki 10 mililitre %2FBS'ye bir mililitre DNAZ bir çözelti ekleyin.

Sindirimi sonlandırın; 300G'de dört derece Celsius'ta beş dakika santrifüj yapın. Sonra her peleti bir mililitre doku dissosiyasyon çözeltisine tekrar askıya alın. Mekanik ayrışmayı desteklemek için çözeltiyi 100 kez pipetleyin.

Sonra, tüm süspansiyonları tek bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne toplayın. Her tüpü iki mililitre tampon ile durulayın ve yıkamaları birleştirin. 300G'de dört derece Celsius'ta beş dakika santrifüj yaptıktan ve en üst katmanı attıktan sonra, 12,5 mililitre %20 BSA ekleyip karıştırmak için ters çevirin.

1000 G'de dört derece Celsius'ta 20 dakika boyunca santrifüj yapın. Şimdi alt pelleti topla ve süpernatantı yeni bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktar. Tekrar santrifüj yapmadan önce nazikçe tekrar askıya alın.

Her peleti PBS'de 2% 2 mililitre FBS'ye yeniden askıya alın. Sonra her iki süspansiyonu tek bir tüpte birleştirin. Kombine süspansiyonu 300G'de dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca santrifüjle yapın.

Süpernatantı attıktan sonra, son pelleti iki mililitre PBS ile %2 FBS ile tekrar askıya alın. Çağrı başına %22 olan dört mililitre santrifüj tüpü içeren dört adet 15 mililitrelik santrifüj tüpü hazırlayın. Her gradyana ve 560G'de dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca 0,5 mililitre hücre süspansiyonu alikotunu nazikçe katmanlayın.

Süpernatant aspirasyondan sonra, her peleti bir mililitre HBSS BSA glukoz tamponunda tekrar askıya alın. Sonra süspansiyonları yeni bir 15 mililitrelik tüpe çekin. Perkol tüplerini iki mililitre tampon ile durulayın ve yıkamaları birleştirin, ardından 300G'de dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca santrifüj yapın.

Akış sitometrisi için, süpernadantı aspire ettikten sonra pelleti bir mililitre HBSS BSA glukoz tamponunda yeniden askıya alın. Beş mikrolitre FC reseptör bloklayıcı reaktif ekleyin ve dört derece Celsius'ta beş dakika kuluçka yapın. Sonra pipetle süspansiyona karşı floresan olarak antikorlar konjuge edildi ve ardından inkübe edildi.

Hücreleri altı mililitre HBSS BSA glikoz tamponu ile yıkayın. Sonra süspansiyonu 300G'de dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı aspire ettikten sonra, pelleti bir mililitre tampon içinde tekrar askıya alın.

Yedi amino aktinomisin D çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin ve 10 dakika boyunca buzda kuluçka yapın. Sonra son hacmi HBSS tamponu ile BSA ve glikozla takviye ederek iki mililitre ayarlayın. Toplama tüplerinin iç yüzeyini %1 BSA çözeltisi ile durulayın.

Fazla çözeltiyi aspire edin, her tüpte tam olarak bir mililitre çözelti bırakın. Tüpleri buzun üzerinde saklayarak sıralanmış hücreleri alabilirsiniz. Beyin dokusundan ayrılan hücreler, akış sitometrisi sıralanması sırasında hücresel kalıntıları dışlamak için ileri saçılma alanı ve yan saçılma alanı ile ardışık olarak kapatılmıştır.

CD45 pozitif ve CD41 pozitif çift pozitif olaylar, hematopoietik hücreler ve trombosit kirleticileri çıkarmak için dışlandı. CD13 pozitif vasküler duvar hücreleri zenginleştirildi. Ve apoptotik hücreler yedi amino aktinomisin D negatif gatingi kullanılarak dışlandı, ardından parazitleri izole etmek için CD31 negatif seçildi.

Akış sitometrisi sıralaması, çekirdekli hücrelerin tüm olayların %59,8'ini oluşturduğunu gösterdi. CD13 pozitif hücreler tüm olayların %1'ini oluşturdu. Ve nihai CD13 pozitif CD31 negatif parazit popülasyonu tüm olayların %0,7'sini oluşturdu.

Sıralanmış hücrelerin UMAP boyut köküntüsünün azaltılması, izole popülasyon içinde hücresel heterojenliği gösteren altı farklı ana küme ortaya çıkardı. Z-skoru normalize ısı haritası analizi, parazit belirteç genlerinin sıfırdan üçe kadar kümelerde yüksek ve ağırlıklı olarak eksprese edildiğini gösterdi. Küme oranı analizi, sıfırdan üçe kadar olan kümelerin toplam nüfusun %87,1'ini oluşturduğunu gösterdi.

Düz kas hücresi belirteçleri dördüncü kümede %10,14 ile zenginleştirilmiş, fibroblast belirteçleri ise beşinci kümede %2,77 ile zenginleştirilmiştir. Bu protokol araştırmacıların aşağı akış tek hücre dizileme ve fonksiyonel analiz için uygun yüksek saflıkta giyilebilir parazitleri izole etmesine olanak tanır. Ana zorluk, son derece spesifik parazit belirteçlerinin olmaması, karmaşık izolasyon ve seküler kontaminasyon riskinin artmasıdır. Gelecekteki çalışmalar, parazite özgü belirteçleri belirlemeye, daha iyi izolasyon, daha derin fonksiyonel karakterizasyon ve hedefli terapötik araştırmalar yapmaya odaklanabilir.