İnsan Cilt Hücrelerinde Tünel Nanotüplerinin Tespit Edilmesi İçin Doku Mühendisliği Uygulamaları İçin Standartlaştırılmış Yöntem

İnsan cilt hücreleri arasındaki tünel nanotüplerini güvenilir şekilde tespit edip analiz etmek ve cilt yenilenmesindeki potansiyel rollerini incelemek için yöntemler geliştirdik. Protokolümüz sabit örnekler veya birincil insan cilt hücreleri için tasarlanmıştır. Cilt biyolojisi ve doku yenilenmesiyle ilgili araştırmalarda faydalıdır.

Başlangıç olarak, uygun büyüme ortamı içeren 60 milimetrelik kaplarda insan epidermal keratinositleri ve dermal fibroblastları eritip kültürlendirin. Keratinosit kültürlerini Y-27632 ile takviye ederek resüsitasyon sırasında son konsantrasyona beş mikro molar ulaştırın. Tüm kültürleri nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde yaklaşık %80 birleşimine ulaşana kadar 37 derece Celsius sıcaklıkta tutun.

Sonra kültür tabaktan ortamı çıkarın. Hücreleri yıkama sırasında fizyolojik pH ve osmolariteyi korumak için bir mililitre PBS ile kısa süreliğine durulayın. PBS'yi tamamen aspire edin.

Bir mililitre %0,05 tripsin EDTA ekleyin ve hücre yüzeyine eşit şekilde dağıtın. Tabağı 37 derece Celsius'ta 1,5 ila 2,5 dakika kuluçka yapın. Hücreleri yukarı aşağı pipetle nazikçe yeniden süsküyde tutun.

Tripsini nötralize etmek için iki mililitre büyüme ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 G'de santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, santrifüj tüpündeki süpernatantı atın.

Hücre pelletini bir ila iki mililitre ortamda yeniden askıya alın ve hücreleri otomatik sayaçla sayın. Sonra, sekiz delikli bir oda slaytının her kuyusuna 12.000 dermal fibroblast veya 20.000 keratinosit tohumu verin, son olarak 400 mikrolitre bir hacimde. Tohumlandıktan sonra, hücreler eşit şekilde dağıtılması için odayı iyi çapraz sallayın ve hücreleri yaklaşık 24 saat boyunca 37 derece Celsius'ta kuluçka altına alın.

İnkubasyon sonrası, hücre birleşmesinin yaklaşık %80 civarında olup olmadığını mikroskop altında doğrulayın. Kültürler %80 birleşmeye ulaştığında, hücrelere ön eklem yapmak için birkaç damla fiksatif çözelti birbirini doğrudan odaya ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında dört dakika kuluçka edin, böylece fiksatif hücreleri rahatsız etmeden eşit şekilde yayılmasını sağlar.

Sonra kuyunun ön fiksatifini aspire edip 140 mikrolitre taze fiksatif bir çözelti ekleyin, böylece kuyu yüzeyinin tam kaplanması sağlanır. Kaydırmayı 37 derece Celsius'ta 15 dakika kuluçka edin. Sonra, fiksatifi haznedeki yuvadan çıkarın ve kalıntı aldehitleri söndürmek için 140 mikrolitre 100 milimolar amonyum klorür ekleyin.

Sürgü sürgüsünü oda sıcaklığında 10 ila 30 dakika kuluçka edin. Numuneleri oda sıcaklığında PBS ile 30 saniye boyunca üç kez durulayın. Her durulama sırasında, hücreleri yıkamamak veya tünel nanotüplerine zarar vermemek için tamponu oda duvarı boyunca nazikçe pipet yapın.

Hücreleri, PBS içinde 1:300 hacimli buğday tohumu agglutinin Alexa Un konjugatı ile 140 mikrolitre kuluçka yapın. Plazma zarı glikoproteinlerini etiketlemek için oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka gerçekleştirin ve membrandan kaynaklanan tünel nanotüplerinin görselleştirilmesini sağlar. Sonra hücreleri PBS ile üç kez, her biri 30 saniye boyunca yıkayın.

Sonra hücreleri 140 mikrolitre falloidin konjugatı ile 1%1 BSA ile 30 dakika boyunca oda sıcaklığında 30 dakika boyunca incelendirin. Hücreleri PBS ile üç kez yıkandıktan sonra, 140 mikrolitre DAPI çözeltisi ile oda sıcaklığında karanlıkta beş dakika kuluçka yapın. Son olarak, her kuyuya iki ila üç damla montaj malzemesi ekleyin ve örneği oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın.

Slaytları en az 20 dakika boyunca karanlıkta dört derece Celsius sıcaklığında saklayıp görüntülemeye kadar kullanın. Dermal fibroblast kültürlerinde, tünel nanotüpleri, bitişik hücreleri buğday tohumu agglutinin ve falloidin ile etiketlenmiş F-aktinle boyanmış membranlarla birbirine bağlayan uzun ince çıkıntılar olarak gözlemlenmiştir. Epidermal keratinosit kültürlerinde, karakteristik F-aktin pozitif çıkıntılara sahip tünel nanotüpleri komşu hücreleri birleştiren de gözlemlenmiştir.

Dermal fibroblastlar ve epidermal keratinositlerin ortak kültürlerinde, dermal fibroblastlar ile epidermal keratinositler arasında tünel nanotüpleri tutarlı şekilde tespit edildi; bunlar zar ve sitokeratin 5 boyama ile görselleştirildi. Ortak kültürlerdeki tünel nanotüpleri, yalnızca F-aktini, her iki filamenti içeren örneklerde çeşitli sitoskelet organizasyonu sergilemiştir; örneğin F-aktini kısmi alfa-tubulinli veya düşük alfa-tubulin seviyelerine sahiptir. En büyük zorluk, tüneli nanotüplerde korumaktır.

Bu, nazik fiksasyon, uygun zamanlama ve taze hazırlanmış sabit katkı maddelerinin kullanılmasını gerektirir. Protokolümüz kullanılarak, tünel nanotüpleri değişken hücre koşullarında ölçülerek potansiyel işlevlerini inceleyebilir. Gelecekte, mitokondrileri tünel nanotüpleri aracılığıyla transferlerini incelemek için floresan olarak etiketleyeceğiz.