Koloni Oluşumu Testi LncRNA Knockdown Osteosarkom Hücrelerinin Proliferatif Kapasitesini Tespit Ediyor

Araştırmam osteosarkoma odaklanmakta ve LncRNA-knockdown'un uzun vadeli proliferatif kapasiteyi koloni bilgi testleri kullanarak nasıl etkilediğini araştırmayı amaçlamaktadır. Başlamak için, 5 adet 143B osteosarkom hücresinin gücüne 5 kez 10 kat tohum tohumu iki 10 santimetre kültür kabına yerleştirilin. Hücreler, %10 fetal sığır serumu ile 37 derece Celsius'ta %5 karbondioksit kuluçka içinde, tam DMEM ile kültürlendirin.

Transfeksiyon reaktiflerini 24 saat sonra hazırlayın; plazmidler, polietilen ve OptiMinium Temel Ortamı dahil. Her reaktifi girdabla kapatın ve kullanmadan önce oda sıcaklığına ulaşmasını sağlayın. Şimdi, plazmidler ve polietilen için dört adet 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünü işaret kalemi ile etiketleyin.

Her tüpe 500 mikrolitre OptiMinium Essential Medium pipet yapın. Daha sonra ilgili plazmid tüpüne 10 mikrogram plazmid ekleyin ve her polietilen tüpüne 30 mikrolitre polietilenin pipetleyin. Her tüpü yukarı aşağı pipetle nazikçe karıştırın ve inkübe yapın.

Şimdi her plazmid tüpünü karşılık gelen polietilenin tüpü ile birleştirin. Karışımı nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın. 143B hücrelerini içeren tabaklardan kültür ortamını nazikçe aspire edin.

Her yemeğe yedi mililitre serumsuz ortam ekleyin ve eklenecek plazmid etiketiyle etiketleyin. Hazırlanan transfeksiyon karışımını ilgili kültür tabakına damla olarak ekleyin. Karışımı dış kenardan dairesel hareketle yemeğin ortasına doğru yavaşça ekleyin.

Hücreleri %5 karbondioksit kuluçka makinesinde 37 derece Celsius sıcaklıkta kuluçka yapın. Süpernatantı 8 ila 12 saat sonra at. Sonra kültür kabına 10 mililitre tam DMEM ekleyip kuluçka yapın.

Ortamı değiştirdikten 72 saat sonra hücreleri floresan mikroskobu altında inceleyin, ortamı kültür kaplarından çıkarın. Hücreleri sindirmek için 1,5 mililitre tripsin-EDTA asit ekleyin. Hücreler nazikçe pipetle yaparak hücreleri ayırır.

Sonra sindirimi sonlandırmak için beş mililitre tam ortam ekleyin. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Sonra hücreleri saymak için hücre süspansiyonundan 20 mikrolitre pipetleyin.

Ribonüklein asit ekstraksiyonu için 5 hücrenin 3 katı 10 sayısını toplayarak çökme verimliliğini doğrulayın. Şimdi 2 kere 10 tohum, her kuyu başına 3 hücre gücünde altı delikli bir plakaya ekleyin. Pipet, DMEM'i tamamlayıp son iki mililitre kadar ulaşır.

Hücreleri %5 karbondioksit kuluçka makinesinde 37 derece Celsius sıcaklıkta kültürleyin. Koloni oluşumunu günlük olarak izleyin. Kültür, kontrol grubundaki çoğu koloni en az 50 hücre içerdiğinde veya 10 ila 14 gün kuluçkadan sonra sonlandırın.

Süpernatantı attıktan sonra, hücreleri her kuyu başına bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın, her yıkamadan sonra çözeltiyi atın. Hücreleri 15 dakika boyunca 10% formalin çözeltisinin bir mililitresinde sabitleyin. Fiksanti atın, ardından hücreleri her kuyu başına bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın.

Hücreleri 10 ila 30 dakika boyunca bir mililitre %0,5 kristal mor çözeltisi ile boyanın. Sonra tabağı yavaşça akan musluk suyla nazikçe yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında hava ile kurutun.

Kolonilerin görüntülerini bir kamera ile çekin. 143B hücrelerin transfeksiyon verimliliği, transfeksiyondan 72 saat sonra floresan mikroskopisi ile doğrulandı ve her iki durumda da verimli plazmid teslimatını gösterdi. RT-qPCR reaksiyon analizi, shSNHG6 ile transfekte edilen 143B hücrelerinde SNHG6 ifadesinin shNC grubuna kıyasla anlamlı şekilde azaldığını gösterdi.

Koloni oluşum testleri, SNHG6 knockdown grubundaki koloni sayısında ve boyutunda kontrol grubuna kıyasla önemli bir azalma göstermiştir. Bu protokol, kısa vadeli metabolik bazlı proliferasyon testlerine kıyasla daha yüksek biyolojik önem ve daha kesin sonuçlar sunan tek hücreli uzun vadeli çorapsiyonu değerlendirir. Gelecekteki çalışmalar, bu protokolü ek LncRNA'lar ve tümör modelleri ile genişleterek kanser hücresi proliferatif potansiyelini düzenleyen mekanizmaları sistematik olarak keşfedecektir.