Name: Mamokür Testi, tümör olmayan meme epitel hücre hatlarında Api5 kaynaklı kök konumunu ortaya koydu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Keşfedin, mamokür testi ile MCF-10A hücrelerinde Api5 aşırı ekspresyonunun kanser kök hücre benzeri özellikleri nasıl tetiklediğini. Bu yöntem, kök hücre belirteçlerinin ekspresyonunu ve kendi kendini yenileme kapasitesini değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Doku kültür plakalarının Poli(2-hidroksietil metakrilat), pHEMA ile kaplanması
<ol>
	<li>1,2 g pHEMA (molekül ağırlığı ̴ 300.000) %95 etanolden oluşan 100 mL'de sürekli karıştırarak 65 °C'de çözülerek %1,2 pHEMA çözeltisi hazırlanır ( bkz. Malzemeler Tablosu).</li>
	<li>Standart doku kültür plakalarını, 6 kuyruklu bir plakanın başına 1 mL uygulanarak pHEMA ile kaplayın. PHEMA çözeltisinin hacmi, doku kültür damarının boyutuna göre ayarlanabilir.</li>
	<li>Tabakları steril koşullarda 40 °C sıcaklıkta fırında kurumasına izin verin.</li>
	<li>Plakaları 15 dakika UV ışığına maruz bırakın, ardından Dulbecco'nun fosfatla tamponlanmış tuzlu suyu (DPBS) ile üç yıkama yapın ve ardından mamokür oluşumu testi için kullanın.</li>
</ol>
2. Birincil nesil mamutsferlerin tohumlanması
<ol>
	<li>Kültür 3D,büyüme ortamında 16. gün 3D kültürlerin dissosiyasyonu ile elde edilen MCF10A hücrelerini (Kontrol ve Api5 aşırı ekspresyonu) dissosiyasyon yaptı. NOT: Büyüme ortamının bileşimi: %5 at serumu takviyesi ile sodyum piruvat içermeyen yüksek glikozlu DMEM, 10 μg/mL insülin, 0,5 μg/mL hidrokortizon, 20 ng/mL rekombinant insan epidermal büyüme faktörü (EGF), 100 ng/mL kolera toksini ve 200 birim/mL penisillin-streptomisin takviyesi (bkz. Materyaller Tablosu).</li>
	<li>Kullanılan ortamı çıkarın, hücreleri 1 mL DPBS ile yıkayınız, ardından %0,05 tripsin-EDTA 500 μL eklenin ve 37 °C'de nemlendirilmiş %5CO2 kuluçka makinesinde 12-15 dakika boyunca kuluçka yapın, tüm hücreler tripsizize olana kadar.</li>
	<li>Tüm hücreler yerinden çıkarıldıktan sonra, tripsin aktivitesini nötralize etmek için 2 mL yeniden süspansiyon ortamı eklenin ve hücre süspansiyonunu 112 × g ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca döndürün. NOT: Yeniden süspansiyon malzemesinin bileşimi: Yüksek glikozlu DMEM, sodyum piruvat içermeden %20 at serumu ve 200 birim/mL penisillin-streptomisin takviyesi.</li>
	<li>Süpernatantı aspire edin ve hücre pelletini 1 mL mamoküre ortamında yeniden süspansiyona salın. Hücre süspansiyonunu 25 G'lik bir iğneden geçirerek tek hücreli süspansiyon elde edin. NOT: Mamosfer ortamının bileşimi: DMEM/F12, 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF) takviyesi, 1 × B27 takviyesi A vitamini içermeyen ve 200 birim/mL penisillin-streptomisin (bkz. Materyaller Tablosu).</li>
	<li>Hemositometre kullanarak, her kuyu başına 0,2 ×10-4 hücre tohumlamak için gereken hücre sayısını sayın ve hücre süspansiyon hacmini hesaplayın. NOT: Mamutfer oluşum verimliliğini doğru şekilde belirlemek için düşük tohumlama yoğunluğunu koruyun, böylece hücre agregasyonunun etkisini en aza indirin. İmmünoblotasyon için protein lizatları toplanırken, hücre yoğunluğu her kuyu başına 2,5 ×10-5 hücreye kadar yükseltilebilir.</li>
	<li>Gerekli hücre süspansiyon hacmini 2 mL mamoküre ortamında seyreltin ve tohumu 6 kuyruklu bir plakanın her kuyusunda incelendirin. Her durum için tohum hücreleri üçlük.</li>
	<li>37 °C'de nemlendirilmiş %5CO2 kuluçka makinesinde 7 gün boyunca kuluçka yapın.</li>
	<li>Yedi gün kültür geçirdikten sonra, her kuyunun çapı 50 μm'den büyük olan mamutküre sayısını manuel olarak saymak için ya gratikül takılı mikroskop ile ya da ışık mikroskobu altında bir dörtre ızgara kullanılarak sayılır.</li>
	<li>Mamutkürleri, ışık mikroskobuna takılmış dijital kamera ile 20x büyütmede görüntüleyin.</li>
	<li>Mamukür oluşum verimliliğini (MFE) aşağıdaki formül5 kullanarak hesaplayın 
	 <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq1v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 1"></li>
</ol>
3. İkincil nesil mamutkürlerin tohumlanması
<ol>
	<li>Birinci nesilde oluşan mamutsferleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve oda sıcaklığında 300 × g boyunca 10 dakika boyunca santrifüj yapın.</li>
	<li>Süpernatantı aspire edin, mamosfer pelletini geride bırakın.</li>
	<li>Pelleti DPBS ile yıka.</li>
	<li>Mamokür pelletine 200 μL %0,05 tripsin-EDTA ekleyin ve nemlendirilmiş %5CO2 kuluçka makinesinde 37 °C'de 2-3 dakika kuluçka yapın. Tripsin çözeltisindeki mamutkürleri 25 G'lik bir iğneden üç kez geçirerek tek hücreli bir süspansiyon elde edin.</li>
	<li>Tripsin aktivitesini nötralize etmek için 0,5 mL resüspansiyon ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 112 × g boyunca döndürün.</li>
	<li>Süpernatantı aspire edin ve hücre pelletini 0,5 mL mamokür ortamında yeniden süspansiyona alın.</li>
	<li>Bir hemositometre kullanarak, her kuyu başına 0,2 ×10-4 hücre tohumlamak için gereken hücre sayısını sayın ve hücre süspansiyon hacmini hesaplayın. NOT: Kendi kendini yenileme kapasitesini değerlendirmek için düşük hücre yoğunluğunu koruyun, böylece hücre toplama etkisini en aza indirin.</li>
	<li>Gerekli hücre süspansiyon hacmini 2 mL mamoküre ortamında seyreltin ve tohumu 6 kuyruklu bir plakanın her kuyusunda incelendirin. Her durum için tohum hücreleri üçlük.</li>
	<li>37 °C'de nemlendirilmiş %5CO2 kuluçka makinesinde 7 gün boyunca kuluçka yapın.</li>
	<li>7 gün kültürde geçirildikten sonra, her plakada çapı 50 μm'den büyük olan mamutküre sayısını, ya graticul ile takılı bir mikroskop ya da bir dörtgen ızgara ile sayın.</li>
	<li>Mamutkürleri, ışık mikroskobuna takılmış dijital kamera ile 20x büyütmede görüntüleyin.</li>
	<li>Kendi kendini yenileme kapasitesini aşağıdaki formül5 kullanarak hesaplayın 
	<img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq2v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 2"></li>
</ol>
4. Api5 aşırı ifadesinde pluripotensi belirteçlerindeki değişiklikleri tespit etmek için Western blotlama
<ol>
	<li>Birinci nesilde oluşan mamutsferleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve oda sıcaklığında 300 × g boyunca 10 dakika boyunca santrifüj yapın.</li>
	<li>Süpernatantı aspire edin, mamosfer pelletini geride bırakın.</li>
	<li>Pelleti DPBS ile yıka.</li>
	<li>Pelleti buz gibi soğuk RIPA tamponunda toplayarak protein lizat elde edin ve standartprotokol 24'e göre immünoblotlama gerçekleştirin. NOT: RIPA tamponunun bileşimi: 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, %1 Triton X-100, %0.5 Sodyum deoksikolat, %0.1 sodyum dodesil sülfat (SDS), 1 mM etilenediamintetraasetik asit (EDTA), 1 mM fenilmetisülfonil florür (PMSF), 10 mM sodyum florür, 1 mM sodyum ortovanat.</li>
	<li>Kök belirteçleri için prob - Oct3/4, Nanog, Sox2 ve BMI1 ve yükleme kontrol GAPDH (bkz. Antikor seyreltmeleri için Malzeme Tablosu ).</li>
	<li>ImageJ üzerinde densitometrik analiz kullanarak protein seviyelerini nicelikle ölçemek. Western blot görsellerinde ilgi alanını seçin ve her şerit için bir yoğunluk profili oluşturun.</li>
	<li>İlgi duyulan proteinin göreceli yoğunluklarını her bir kanal için GAPDH'nin yoğunluklarına normalleştirin. Her protein için katlama değişimini hesaplayın.</li>
	<li>Protein seviyelerindeki fold değişimini herhangi bir grafik yazılımıyla çizin.</li>
</ol>

<ol><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl Cancer Inst. 100 (9), 672-679 (2008).</li>
<li>Creighton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (33), 13820-13825 (2009).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Grimshaw, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Res. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li>
<li>Kim, R. J., Nam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OCT4+expression+enhances+features+of+cancer+stem+cells+in+a+mouse+model+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Res%22%5BJournal%5D)">OCT4 expression enhances features of cancer stem cells in a mouse model of breast cancer.</a> Lab Anim Res. 27 (2), 147-152 (2011).</li>
<li>Lu, X., Mazur, S. J., Lin, T., Appella, E., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pluripotency+factor+nanog+promotes+breast+cancer+tumorigenesis+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The pluripotency factor nanog promotes breast cancer tumorigenesis and metastasis.</a> Oncogene. 33 (20), 2655-2664 (2014).</li>
<li>Leis, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+expression+in+breast+tumours+and+activation+in+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells.</a> Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).</li>
<li>Paranjape, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+regulates+self-renewal+and+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+breast+cancer+cells+through+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Bmi1 regulates self-renewal and epithelial to mesenchymal transition in breast cancer cells through Nanog.</a> BMC Cancer. 14 (1), 785(2014).</li>
<li>Bousquet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+apoptosis+protein+%28Api-5%29+in+chemoresistant+triple-negative+breast+cancers%3A+an+innovative+target%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High expression of apoptosis protein (Api-5) in chemoresistant triple-negative breast cancers: an innovative target.</a> Oncotarget. 10 (61), 6577-6588 (2019).</li>
<li>Basset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Api5+a+new+cofactor+of+estrogen+receptor+alpha+involved+in+breast+cancer+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Api5 a new cofactor of estrogen receptor alpha involved in breast cancer outcome.</a> Oncotarget. 8 (32), 52511-52526 (2017).</li>
<li>Kuttanamkuzhi, A., Panda, D., Malaviya, R., Gaidhani, G., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+anti-apoptotic+protein+Api5+affects+breast+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Altered expression of anti-apoptotic protein Api5 affects breast tumorigenesis.</a> BMC Cancer. 23 (1), 374(2023).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor-5+overexpression+is+associated+with+tumor+progression+and+poor+prognosis+in+patients+with+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor-5 overexpression is associated with tumor progression and poor prognosis in patients with cervical cancer.</a> BMC Cancer. 14 (1), 545(2014).</li>
<li>Jang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+induces+cisplatin+resistance+through+FGFR+signaling+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">API5 induces cisplatin resistance through FGFR signaling in human cancer cells.</a> Exp Mol Med. 49 (9), e374(2017).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+increases+metastasis+via+Erk-mediated+MMP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 increases metastasis via Erk-mediated MMP expression.</a> BMB Rep. 48 (6), 330-335 (2015).</li>
<li>Krejci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiapoptotic+protein+Api5+and+its+partner%2C+high+molecular+weight+FGF2%2C+are+up-regulated+in+B+cell+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">The antiapoptotic protein Api5 and its partner, high molecular weight FGF2, are up-regulated in B cell chronic lymphoid leukemia.</a> J Leukoc Biol. 82 (6), 1363-1364 (2007).</li>
<li>Koci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+%28API-5%3B+AAC-11%3B+FIF%29+is+upregulated+in+human+carcinomas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 (API-5; AAC-11; FIF) is upregulated in human carcinomas in vivo.</a> Oncol Lett. 3 (4), 913-916 (2012).</li>
<li>Phi, L. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+%28CSCs%29+in+drug+resistance+and+their+therapeutic+implications+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells (CSCs) in drug resistance and their therapeutic implications in cancer treatment.</a> Stem Cells Int. 2018 (1), 5416923(2018).</li>
<li>Zhou, H. M., Zhang, J. G., Zhang, X., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+stem+cells+for+reversing+therapy+resistance%3A+mechanism%2C+signaling%2C+and+prospective+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer stem cells for reversing therapy resistance: mechanism, signaling, and prospective agents.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 62(2021).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+confers+cancer+stem+cell-like+properties+through+the+FGF2-NANOG+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">API5 confers cancer stem cell-like properties through the FGF2-NANOG axis.</a> Oncogenesis. 6 (1), e285(2017).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-nitroso-N-ethylurea+activates+DNA+damage+surveillance+pathways+and+induces+transformation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells.</a> BMC Cancer. 14 (1), 287(2014).</li>
<li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open%3Aa+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open:a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li>
<li>Eyre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+mammosphere+and+xenograft+tumour+initiation+correlates+with+progression+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Patient-derived mammosphere and xenograft tumour initiation correlates with progression to metastasis.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 21 (3-4), 99-109 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin EDTA&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C humidifiye inkübatör</td><td>New Brunswick</td><td>Galaxy 170 R</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Bmi1 Tavşan pAb</td><td>ABclonal</td><td>A13472</td><td>1:1000 seyreltik, 4 &deg;C'de gece boyu inkübasyon</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antikoru</td><td>Sigma</td><td>G9545-200UL</td><td>1:10000 seyreltik, oda sıcaklığında 1 saatlik inkübasyon</td></tr><tr><td>Anti-Nanog Tavşan mAb</td><td>ABclonal</td><td>A22625</td><td>1:5000 seyreltik, 4 &deg;C'de gece boyu inkübasyon</td></tr><tr><td>Anti-Oct3/4 Antikoru (C-10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1:300 seyreltik, 4 &deg;C'de gece boyu inkübasyon</td></tr><tr><td>Anti-Sox2 Antikoru (E-4)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365823</td><td>1:300 seyreltik, 4 &deg;C'de gece boyu inkübasyon</td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi (50x), vitamin A içermeyen</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr><tr><td>Kolera toksini&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td>&nbsp;dH2O içinde 1 mg/mL stoğu</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal büyüme faktörü (EGF)&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E9644-0.2MG&nbsp;</td><td>dH2O içinde 100 mg/mL stoğu</td></tr><tr><td>Etanolü mutlak 99.9%</td><td>Jebsen &amp; Jessen GmbH &amp; Co. Almanya</td><td>58051 L05</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat (EDTA)</td><td>SRL</td><td>43272</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek glikozlu DMEM, sodyum pirüvatsız</td><td>Invitrogen</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>Ateş atı serumu&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>Hydroklorik asit (HCl)</td><td>Qualigens</td><td>Q29145</td><td>Tris-HCl'in (pH 8.0) pH'ını ayarlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Hidrokortizon&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;&nbsp;</td><td>H0888</td><td>Etanol içinde 1 mg/mL stoğu</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Görüntü işleme yazılımı</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western kimilüminisan HRP substratı</td><td>Merck</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I1882&nbsp;</td><td>%1 glasiyal asetik asit içinde 10 mg/mL stoğu</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS-100 mikroskopu</td><td>Nikon</td><td>BM-1919</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A hücreleri</td><td></td><td></td><td>Prof. Raymond C. Stevens'tan (Scripps Research Institute, ABD) hediye</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin&nbsp;</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetil sülfonil florür (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>78830-5G</td><td></td></tr><tr><td>Grafik yazılımı&nbsp;</td><td>GraphPad Prism 10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poli(2-hidroksietil metakrilat) (pHEMA)</td><td>Santacruz</td><td>sc-253284</td><td>%95 etanol içinde %1.2 pHEMA</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>SRL</td><td>41721</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum desoksikolat</td><td>Amresco</td><td>0613-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat (SDS)</td><td>SRL</td><td>54468</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum florür (NaF)</td><td>HiMedia</td><td>RM1081-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum ortovanadat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tris tamponu</td><td>SRL</td><td>71033</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr></tbody></table>

mamokür testi, tümör olmayan meme epitel hücre hatlarında api5 kaynaklı kök konumunu ortaya koydu

Mammosphere Assay Reveals Api5-Induced Stemness in Non-Tumorigenic Breast Epithelial Cell Lines

Yapışmayan koşullarda mamosfer oluşum verimliliğini değerlendirmek için, protokole göre kontrol ve Api5 aşırı ekspresyonlu 3D dissosiyasyon MCF10A hücreleri, poliHEMA kaplı plakalara yerleştirildi. Api5 aşırı eksprese hücreleri, kontrollere göre ortalama mamokür oluşum verimliliğinde 1,58 kat artış göstermiştir (Şekil 1B,C). Bu artış, Api5'in daha yüksek ekspresyonunun, yapışmayan, serum yoksunluğu koşullarında hayatta kalıp çoğalan kök hücre benzeri öncüllerin oranını artır...

Mamokür Testi, tümör olmayan meme epitel hücre hatlarında Api5 kaynaklı kök konumunu ortaya koydu

Breast cancer remains the most prevalent cancer among women globally, with the highest age-standardised incidence and mortality rates. Despite the ...

mammosphere-assay-reveals-api5-induced-stemness-non-tumorigenic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, meme kanseri hücre hatlarından kanser kök hücrelerinin izole edilmesi anlatılmaktadır. Bu kanser kök hücrelerini, kendini yenilemeyi değerlendirmek ve küre oluşturma verimliliğini hesaplamak için birincil mamosferler oluşturmak üzere kültüre ediyoruz ve farklı tohumlama yoğunlukları arasında karşılaştırmaya izin veriyoruz.

Birincil Mamosferlerin Üretimi: Hücre Potansiyelini Belirlemek İçin Bir Teknik

Insan meme cerrahi ıskarta malzeme işlemek için bir yöntem tarif edilmiştir. Organoids şeklinde işlenmiş doku, süresiz olarak dondurulmuş ya da uzun süreli büyüme için kültür içinde yerleştirilmiş saklanabilir. Bu yöntem deneysel normal insan epitel hücre biyolojisi incelenmesi ve eksojen pertürbasyonların etkileri sağlar.

Hücre Kültürü İnsan Azaltma Meme Cerrahisi ve Mastektomi Doku İşleme

Time-lapse görüntüleme özgü davranışsal parametreler ve farklı genetik lezyonlar arasında bir korelasyon olup olmadığını belirlemek için meme kanseri riskinin genetik fare modelleri türetilmiştir birincil preneoplastic meme epitel hücrelerinin davranışlarını değerlendirmek için kullanılır.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Sağlam doku organoids kullanılarak primer hücre kültürü çok hücresel in vivo mikroortam taklit eden bir model sistemi sağlar. Biz enzimatik doku hasarı olmadan, morfoloji farklılaşmış karışık hücre kültürü soyları ve sergiler yaşatan bir serum serbest birincil meme epitel doku kültürü modeli geliştirmiştir. Meme organoids&gt; 6 ay için geçerli kalır.

Enzimatik olmayan, Mammospheres spontan Üretimi için Ön-invaziv Meme Lezyonların Serum serbest Doku Kültürü

İn vitro küre testleri, kanser kök hücrelerini tanımlamak için yaygın olarak kullanılır. Burada tek ve çok hücreli küre tahlillerini karşılaştırıyoruz. Daha zahmetli tek hücre bazlı tahliller veya metilselüloz takviyesi daha doğru sonuçlar verirken, sıvı ortamda gerçekleştirilen çok hücreli bazlı tahliller hücre yoğunluğundan büyük ölçüde etkilenebilir.

Çoklu ve tek hücre bazlı küreler tahliller kullanılarak, insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde Kök Hücre Özelliklerinin Değerlendirilmesi

Yüzen mamosfer tahlilleri, süspansiyon koşullarında hayatta kalan ve farelere implante edildiğinde gelişmiş tümör oluşumu gösteren kök benzeri meme kanseri hücrelerinin alt kümesini araştırabilir.  Bu protokol, kök ile ilişkili transkripsiyonel manzaranın analizini kolaylaştırırken, in vivo tümörijenez için bir vekil olan küre oluşturma yeteneğinin uygun bir in vitro ölçümünü sağlar.

İnsan Göğüs Kanseri dokuları ve hücre hatlarından gelen Mammosphere Oluşumu Testi

Bu metodolojinin amacı, kanser hücre hatlarındaki kanser kök hücrelerini (CSC) ve primer insan tümör örneklerini küre oluşturma protokolü ile sağlam bir şekilde, fonksiyonel tahliller ve akış sitometrisi ve Batı ile henotypik karakterizasyon kullanarak tanımlamaktır. Leke.

Jinekolojik ve Meme Kanseri Tümörlerinden Kanser Kök Hücre Kürelerinin Alınması

Burada, in vitro mammosphere öz-yenileme nicel tahsin sonuçlarının uygulanması ve yorumlanması açıklanmaktadır.

Murine Mammosphere Kültürlerde Kendini Yenileme Nin Niceliği

Bu protokol, insan meme hücrelerinin dönüşümünü değerlendirmek için deneysel in vitro araçlar sağlar. Hücre çoğalma hızının takibi, ankraj-bağımsız büyüme kapasitesi ve hücre soylarının 3Boyutlu kültürlerde bazal membran matrisi ile dağılımı nın detaylı adımları tanımlanmıştır.

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Bu deneysel protokol, BCSC'lerin meme kanseri hücre ve doku örneklerinden izolasyonunun yanı sıra BCSC fenotipini ve fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilecek in vitro ve in vivo testleri tanımlamaktadır.

İnsan Meme Kanseri Kök Hücrelerinin Hücre ve Doku Örneklerinden İzolasyonu ve Fonksiyonel Değerlendirmesi

Bu protokol, fare meme bezinde paralel in vivo gen nakavt ve aktivasyon çalışmalarını mümkün kılan ölçeklenebilir bir intraduktal CRISPR tarama yaklaşımını tanımlar.

Fare Meme Bezinde Gen Nakavt ve Aktivasyonun Paraleli In Vivo Taraması

Keşfedin, mamokür testi ile MCF-10A hücrelerinde Api5 aşırı ekspresyonunun kanser kök hücre benzeri özellikleri nasıl tetiklediğini. Bu yöntem, kök hücre belirteçlerinin ekspresyonunu ve kendi kendini yenileme kapasitesini değerlendirir.

Mamokür Testi, tümör olmayan meme epitel hücre hatlarında Api5 kaynaklı kök konumunu ortaya koydu

Daha fazla video keşfet