ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, destekleri ve dokümantasyonları için Seurat, Giotto ve SPOTlight paketlerinin geliştiricilerine ve yöneticilerine teşekkür ederler. Kamu veri depolarının katkıları ve veri setlerini cömertçe paylaşan araştırmacılar da minnetle anılmaktadır.

<ol>
	<li>Ozirmak Lermi N, Molina Ayala M, Hernandez S, et al. Comparison of imaging based single-cell resolution spatial transcriptomics profiling platforms using formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples. Nat Commun. 2025;16(1):8499.</li>
	<li>Ren P, Zhang R, Wang Y, et al. Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors. Nat Commun. 2025;16(1):9232.</li>
	<li>Danishuddin, Khan S, Kim JJ. Spatial transcriptomics data and analytical methods: An updated perspective. Drug Discovery Today. 2024;29(3):103889.</li>
	<li>Xu Z, Wang W, Yang T, et al. STOmicsDB: A comprehensive database for spatial transcriptomics data sharing, analysis and visualization. Accessed October 31, 2025. https://dx.doi.org/10.1093/nar/gkad933</li>
	<li>Wang G, Wu S, Xiong Z, Qu H, Fang X, Bao Y. CROST: A comprehensive repository of spatial transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D882-D890.</li>
	<li>Chen JG, Ch&#225;vez-Fuentes JC, O&#8217;Brien M, et al. Giotto Suite: a multiscale and technology-agnostic spatial multiomics analysis ecosystem. Nat Methods. 2025;22(10):2052-2064. doi:10.1038/s41592-025-02817-w</li>
	<li>Butler A, Hoffman P, Smibert P, Papalexi E, Satija R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nat Biotechnol. 2018;36(5):411-420.</li>
	<li>Elosua-Bayes M, Nieto P, Mereu E, Gut I, Heyn H. SPOTlight: seeded NMF regression to deconvolute spatial transcriptomics spots with single-cell transcriptomes. Nucleic Acids Res. 2021;49(9):e50-e50.</li>
	<li>McCarthy DJ, Campbell KR, Lun ATL, Wills QF. Scater: pre-processing, quality control, normalization and visualization of single-cell RNA-seq data in R. Bioinformatics. 2017;33(8):1179-1186.</li>
	<li>Lun ATL, McCarthy DJ, Marioni JC. A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data with bioconductor. F1000Research. Preprint posted online October 31, 2016. doi:10.12688/f1000research.9501.2</li>
	<li>Miller BF, Huang F, Atta L, Sahoo A, Fan J. Reference-free cell type deconvolution of multi-cellular pixel-resolution spatially resolved transcriptomics data. Nat Commun. 2022;13(1):2339.</li>
	<li>Palla G, Spitzer H, Klein M, et al. Squidpy: A scalable framework for spatial omics analysis. Nat Methods. 2022;19(2):171-178.</li>
	<li>Luecken MD, B&#252;ttner M, Chaichoompu K, et al. Benchmarking atlas-level data integration in single-cell genomics. Nat Methods. 2022;19(1):41-50.</li>
	<li>Hafemeister C, Satija R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biol. 2019 Dec 23;20(1):296.</li>
	<li>Cuevas-Diaz Duran R, Wei H, Wu J. Data normalization for addressing the challenges in the analysis of single-cell transcriptomic datasets. BMC Genomics. 2024;25(1):444.</li>
	<li>Sun S, Zhu J, Zhou X. Statistical analysis of spatial expression patterns for spatially resolved transcriptomic studies. Nat Methods. 2020;17(2):193-200.</li>
	<li>Jin S, Plikus MV, Nie Q. CellChat for systematic analysis of cell&#8211;cell communication from single-cell transcriptomics. Nat Protoc. 2025;20(1):180-219.</li>
	<li>Zohora FT, Paliwal D, Flores-Figueroa E, et al. CellNEST reveals cell&#8211;cell relay networks using attention mechanisms on spatial transcriptomics. Nat Methods. 2025;22(7):1505-1519.</li>
	<li>Wang Q, Zhu H, Deng L, et al. Spatial transcriptomics: Biotechnologies, computational tools, and neuroscience applications. Small Methods. 2025;9(5):2401107.</li>
	<li>Chen MM, Gao Q, Ning H, et al. Integrated single-cell and spatial transcriptomics uncover distinct cellular subtypes involved in neural invasion in pancreatic cancer. Cancer Cell. 2025;43(9):1656-1676.e10.</li>
	<li>Li H, Guan W, Huang J, et al. A complete model of mouse embryogenesis through organogenesis enabled by chemically induced embryo founder cells. Cell. 2025;188(21):5912-5930.e20.</li>
	<li>Loh JW, Lee JY, Lim AH, et al. Spatial transcriptomics reveal topological immune landscapes of asian head and neck angiosarcoma. Commun Biol. 2023;6(1):461. </li>
</ol>

Yazarlar, herhangi bir rakip finansal çıkar beyan etmemektedir.

Bu protokol, analitik derinlik ile pratik erişilebilirliği dengeleyen, mekansal transkriptomik veri analizi için kapsamlı bir hesaplamalı iş akışı sunmaktadır. Adım adım ilerleyen bu yaklaşım, kritik karar noktalarını ve olası pitfalls'leri vurgularken, araştırmacıya başlangıç veri ediniminden gelişmiş mekansal analizlere kadar tüm analitik hatt boyunca rehberlik eder.
Protokoldeki birkaç adım, sonraki sonuçlar üzerindeki etkileri nedeniyle özel dikkat gerektirmektedir. Kalite kontrol ve filtreleme eşikleri, belirli doku tiplerine ve teknoloji platformlarına göre dikkatlice ayarlanmalıdır; çünkü aşırı katı filtreleme biyolojik olarak ilgili noktaları ortadan kaldırabilirken, gevşek eşikler teknik gürültüye yol açabilir. Normalizasyon yöntemi seçimi, sonraki kümeleme ve diferansiyel ekspresyon sonuçlarını önemli ölçüde etkiler. Örneğin, standart log-normalizasyon yerine SCTransform kullanılmıştır; çünkü SCTransform'un tek hücreli ve mekansal iş akışlarında sekanslama derinliği ve diğer teknik etkilerle ilgili teknik varyasyonu modellediği ve azalttığı bildirilmiştir14,15. Entegrasyon sırasında, entegrasyon özelliklerinin ve çözünürlük parametrelerinin seçimi, entegrasyon gücü ile biyolojik sinyalin korunması arasındaki dengeyi sağlamak için dikkatle değerlendirilmelidir. Mekansal olarak değişken gen belirleme işlemi için, veri seti boyutuna ve çalışma hedeflerine bağlı olarak SPARK gibi alternatif belirleyiciler değerlendirilebilse de, hesaplama ölçeklenebilirliği ve dizi tabanlı verilerde mekansal otokorelasyon analizine uygunluğu nedeniyle Moran's I seçilmiştir16.
Bu iş akışının sorun giderme bileşeni, çıktıların bir paketten diğerine aktarılması sırasında meydana gelen yaygın birlikte çalışabilirlik sorunlarına odaklanmaktadır. İş akışı, tek bir genel dönüştürme adımına güvenmek yerine, her yazılım arayüzünde özelleştirilmiş format dönüştürmeleri kullanır: uzamsal sayım verileri Seurat entegrasyonundan önce standart bir RNA analiz yuvasına kopyalanır; Seurat ve tek hücre referans nesneleri SPOTlight için SingleCellExperiment nesnelerine dönüştürülür; uzamsal sayım matrisleri STdeconvolve için yeniden formatlanır; Seurat kaynaklı sayımlar, koordinatlar ve hücre tipi meta verileri hücre-hücre iletişimi analizi için bir Giotto nesnesine dönüştürülür ve Select Spatial Spots'tan gelen ROI anotasyonları, Seurat nesnesine geri eşlenebilmeleri için CELL_ID, X/Y koordinatları ve grup etiketlerini içeren CSV dosyaları olarak dışa aktarılır. Bu adımlar, kullanıcıların uyumsuz analiz yuvaları, eşleşmeyen spot tanımlayıcıları, eksik meta veri sütunları, hatalı koordinat formatlama ve ligand-reseptör gen sembolü uyumsuzlukları gibi yaygın sorunları tanımlamalarına ve düzeltmelerine yardımcı olur.
Bu iş akışının ek bir özelliği, tek bir algoritmaya güvenmek yerine birbirini tamamlayan iki farklı dekonvolüsyon stratejisinin kullanılmasıdır. SPOTlight, hücre tipi oranlarının referans kılavuzlu tahmini için önceden belirlenmiş scRNA-seq referanslarını kullanırken, STdeconvolve latent transkripsiyonel konuların referanssız şekilde keşfedilmesine olanak tanır. Demonstrasyon veri setinde, STdeconvolve konuları histolojik olarak tanımlanmış bölgelerle uyum göstermiştir (Şekil 5B), bu da biyolojik yorumlanabilirliği desteklemektedir. Bu protokolde iki yöntem arasında doğrudan kantitatif bir karşılaştırma yapılmamıştır; bu yöntemleri kendi verileri üzerinde kıyaslamak isteyen kullanıcılar, protokol adım 7.3.2'de sunulan çerçeveyi takip edebilirler. Ayrıca protokol, temel fonksiyonlar için script'ler kullanırken sezgisel ROI izolasyonu için grafiksel bir arayüz (Select Spatial Spots) sunarak kullanılabilirliği ve izlenebilirliği desteklemektedir.
Seurat ve Giotto'nun birbirine bağlanması, iş akışının Seurat tabanlı ön işlemeyi ve entegrasyonu, Giotto tabanlı mekânsal istatistikler ve ağ analizi ile birleştirmesine olanak tanır. Seurat, scRNA-seq deneyimi olan araştırmacılar için yerleşik bir ortam sağlar ve çoklu örnek entegrasyonunu destekler; uyumlaştırılmış verilerin Giotto'ya aktarılması ise mekânsal ağ oluşturulmasına ve ligand-reseptör analizine imkan verir. Bu tasarım, kullanıcıların her iki platformun belgelenmiş güçlü yönlerinden yararlanmasını sağlar; ancak bu durum, platformların burada Squidpy veya diğer çerçevelerle kıyaslandığı anlamına gelmez. Hücre-hücre iletişimi için, aynı analiz ortamında mekânsal komşuluğu dahil ettiği için Giotto'nun Delaunay ağı tabanlı ligand-reseptör çıkarımı kullanılmıştır; CellChat gibi çerçeveler kapsamlı sinyal veri tabanları sunmaktadır ancak bu protokolde değerlendirilmemiştir17.
Bazı kısıtlamalar göz önünde bulundurulmalıdır. Referans tabanlı dekonvolüsyon yaklaşımı, yüksek kaliteli ve eşleşmiş tek hücre referanslarının mevcudiyetine kritik düzeyde bağımlıdır. Ayrıca, hücre-hücre iletişimi analizinin temelindeki varsayımlar, fiziksel protein etkileşimi için bir vekil olarak transkript ko-ekspresyonuna dayanır ve bu durum daha sonra deneysel doğrulamayı gerektirir. Son olarak, bu iş akışı öncelikle standart Visium veri setleri etrafında geliştirilmiştir. Alan, Visium HD gibi tek hücreye yakın çözünürlükteki teknolojilere doğru ilerledikçe, analitik değerlendirmeler değişecektir; daha yüksek çözünürlüklü veriler farklı ön işlem parametreleri gerektirebilir ve spot dekonvolüsyonuna duyulan mutlak ihtiyacı azaltabilir. Bu iş akışını Visium HD veri setlerine uyarlamak için, yüksek çözünürlüklü bin'ler hesaplamalı olarak daha büyük mekansal bin'ler şeklinde birleştirilebilir veya spot dekonvolüsyon modülleri yerine görüntü tabanlı hücre segmentasyonu tercih edilebilir18.
Bu özellikler; gelişimsel biyoloji, nörobilim, kanser araştırmaları ve immünoloji dahil olmak üzere çeşitli biyolojik alanlarda potansiyel uygulanabilirliğe işaret etmektedir19,20,21,22. Modüler tasarım, araştırmacıların ister uzamsal alan tanımlamaya, ister hücresel iletişime veya bölgesel uzmanlaşmaya odaklansınlar, belirli bileşenleri kendi ihtiyaçlarına göre uyarlamalarına olanak tanır. Uzamsal teknolojiler gelişmeye ve veri setleri genişlemeye devam ederken, bu protokol, yeni analitik yöntemleri bünyesine katabilecek ve ortaya çıkan biyolojik soruları yanıtlayabilecek genişletilebilir bir temel sunmaktadır.

Uzamsal transkriptomik (ST), doku kesitlerindeki haberci RNA (mRNA) moleküllerinin uzamsal koordinatlarını korurken genom genelindeki gen ekspresyonunu ölçen dönüştürücü bir teknoloji ailesidir. ST yöntemleri, konum barkodlu diziler kullanan sekanslama tabanlı yaklaşımları ve bozulmamış doku mikroortamlarındaki transkripsiyonel sinyalleri haritalayan in situ görüntüleme yaklaşımlarını içerir1,2. Uzamsal bağlamı koruyarak ST; doku mimarisinin, hücresel komşuluk organizasyonunun, hücre-hücre iletişiminin ve doku disosyasyonundan sonra tam olarak çözümlenemeyen mikroortamla ilişkili biyolojik süreçlerin analizine olanak tanır3.
Kamuya açık ST veri depolarının hızla büyümesi, ikincil analizler ve yöntem geliştirme için benzeri görülmemiş fırsatlar yaratmıştır3. CROST veri tabanı gibi kaynaklar, birden fazla tür ve teknoloji platformunda yüzlerce mekânsal olarak çözünürlemiş transkriptomik veri setini derlerken, STOmicsDB gibi özel koleksiyonlar Stereo-seq gibi belirli metodolojilere odaklanmaktadır4,5. Bu veri bolluğuna rağmen, mekânsal veri yapılarının karmaşıklığı, analitik araçların çeşitliliği ve tekrarlanabilir iş akışlarının uygulanmasındaki teknik engeller nedeniyle hesaplamalı analizler zorlayıcı olmaya devam etmektedir6,7,8,9,10,11.
Tek bir yazılım ortamına güvenmenin getirdiği sınırlamaları gidermek amacıyla, burada tamamlayıcı analitik araçlar kullanan entegre bir hesaplamalı iş akışı sunulmaktadır. Mevcut kapsamlı ST analiz ekosistemleri temel olarak Seurat, Giotto ve Squidpy6,7,12 gibi Python tabanlı çerçeveleri içermektedir. Squidpy gibi Python tabanlı araçlar uzaysal grafik analizi için kapsamlı işlevler sunsa da temel hesaplama hattının tek bir programlama dili ortamında birleştirilmesi, diller arası teknik engelleri en aza indirir. Bu nedenle, diller arası teknik engelleri azaltmak için ana işlem hattı temel olarak R dilinde uygulanmıştır. Tek hücreli ve uzaysal transkriptomik iş akışlarındaki yaygın kullanımını yansıtacak şekilde, bu R tabanlı iş akışında Seurat; veri yükleme, kalite kontrol, normalizasyon, boyut indirgeme, görselleştirme ve çoklu örnek entegrasyonu için kullanılmıştır. Daha sonra, uzaysal ağ kurulumu ve ligand-reseptör tabanlı hücre-hücre iletişimi analizi için Giotto kullanılmıştır. Dolayısıyla bu işlem hattı, iki araç seti arasındaki veri transferini açık ve tekrarlanabilir tutarken, Seurat tabanlı ön işleme ve entegrasyonu Giotto tabanlı uzaysal analizle ilişkilendirmektedir.
Bu çerçeve kapsamında, iki tamamlayıcı dekonvolüsyon stratejisi uygulanmaktadır: hücre tipi oranlarını tahmin etmek için scRNA-seq verilerini kullanan referans kılavuzlu bir yöntem olan SPOTlight ve gizli transkripsiyonel paternleri tanımlayan denetimsiz bir konu modelleme yöntemi olan STdeconvolve8,11. Elde edilen çıktılar, mekânsal hücresel heterojenliğe dair birbirini tamamlayıcı görünümler sunar; ancak kullanıcılar protokolde açıklanan isteğe bağlı uyumluluk analizini gerçekleştirmediği sürece bunlar nicel bir çapraz doğrulama olarak değerlendirilmez. İnteraktif ilgi alanı (ROI) anotasyonu için özel bir Python Dash uygulaması olan Select Spatial Spots entegre edilmiştir ve bu uygulama, sonraki alt analizlerde kullanılabilecek standart koordinat tabanlı anotasyon dosyaları dışa aktarır.
Pratik uygulanabilirlik açısından, bu iş akışı öncelikle standart dizi tabanlı ST verileri (örneğin, 55 µm çözünürlüklü Visium) için tasarlanmıştır ve parametre değerlendirmesinin ardından diğer doku türlerine uyarlanabilir. Analizden önce temel sınırlamalar dikkate alınmalıdır. İlk olarak, referans kılavuzlu dekonvolüsyon modülü, yüksek kaliteli ve dokuyla eşleşen bir scRNA-seq referansına bağlıdır. İkinci olarak, hücre altı veya tek hücreye yakın platformlar, entegrasyon öncesinde modifiye edilmiş ön işleme, mekansal kutucuk agregasyonu veya görüntü tabanlı hücre segmentasyonu gerektirebilir2. Temsili fare kolon veri seti, evrensel platform uyumluluğunun bir kanıtı olarak değil, iş akışının mekansal alanları ve belirteçle tanımlanmış doku organizasyonunu nasıl değerlendirebileceğini göstermek için bir gösterim vakası olarak kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>ggplot2</td><td>Posit Software, PBC</td><td>v4.0.0(CRAN)</td><td>Gelişmiş veri görselleştirme</td></tr><tr><td>Giotto</td><td>Dries Lab</td><td>v4.2.2 (GitHub)</td><td>Uzamsal ağ ve hücre-hücre iletişimi analizi</td></tr><tr><td>patchwork&amp;nbsp;</td><td>Thomas Lin Pedersen</td><td>v1.3.2 (CRAN)</td><td>Grafik kompozisyonu ve düzenleme</td></tr><tr><td>R software&amp;nbsp;</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>v4.4.3</td><td>Çekirdek yürütme ortamı (macOS aarch64)</td></tr><tr><td>scater</td><td>Davis McCarthy et al.</td><td>v1.34.1 (Bioconductor)</td><td>Tek hücreli kalite kontrolü ve görselleştirme</td></tr><tr><td>scran</td><td>Aaron Lun et al.</td><td>v1.34.0 (Bioconductor)</td><td>Tek hücreli varyans modelleme ve belirteç tespiti</td></tr><tr><td>Select Spatial Spots (Özel Python Aracı)</td><td>LeafLight</td><td>v1.0.0 (GitHub)</td><td>Etkileşimli uzamsal ilgi alanı (ROI) seçimi (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)</td></tr><tr><td>Seurat&amp;nbsp;</td><td>Satija Lab</td><td>v5.3.0 (CRAN)</td><td>Uzamsal veri ön işleme, entegrasyon ve kümeleme</td></tr><tr><td>SeuratObject&amp;nbsp;</td><td>Satija Lab</td><td>v5.2.0 (CRAN)</td><td>Tek hücreli ve uzamsal veriler için veri yapıları</td></tr><tr><td>SingleCellExperiment</td><td>Bioconductor Core Team</td><td>v1.28.1 (Bioconductor)</td><td>scRNA-seq için standartlaştırılmış veri konteyneri</td></tr><tr><td>SPOTlight</td><td>Marc Elosua-Bayes et al.</td><td>v1.10.0 (Bioconductor)</td><td>Referans kılavuzlu uzamsal dekonvolüsyon</td></tr><tr><td>Stdeconvolve</td><td>Jean Fan Lab</td><td>v1.3.2 (Bioconductor)</td><td>Denetimsiz gizli konu modelleme</td></tr><tr><td>tidyverse</td><td>Posit Software, PBC</td><td>v2.0.0 (CRAN)</td><td>Çekirdek veri manipülasyonu ve biçimlendirme paketi</td></tr></tbody></table>

siyasal transkriptomik veri analizi İçin pratik bir İş akışı: veri eldesinden İleri analizlere

A Practical Workflow for Spatial Transcriptomics Data Analysis: From Data Acquisition to Advanced Analyses

Uzamsal transkriptomik (ST), doku kesitleri içindeki mRNA moleküllerinin iki boyutlu uzamsal bağlamını koruyarak genom genelindeki gen ifadesini profiller ve böylece doku mimarisi ve mikroçevreyle ilişkili biyolojinin incelenmesine olanak tanır. Ancak, veri aktarımı, kalite kontrolü, entegrasyon, dekonvolüsyon, uzamsal istatistikler ve görselleştirme genellikle birden fazla yazılım ortamı ve tekrarlanabilir parametre seçimleri gerektirdiğinden, ST analizi zorlayıcı olmaya devam etmektedir. Bu protokol, veri edinimi ve yazılım kurulumu ile başlayıp Seurat tabanlı veri yükleme, kalite kontrolü, normalizasyon, çoklu örnek entegrasyonu, kümeleme ve uzamsal olarak değişken gen analizi ile devam eden, R dilinde halka açık ST veri setleri için pratik bir hesaplama iş akışı sunmaktadır. İş akışı daha sonra, referans kılavuzlu SPOTlight analizi ve denetimsiz STdeconvolve konu modellemesini içeren tamamlayıcı dekonvolüsyon stratejilerini, ardından Giotto tabanlı uzamsal hücre-hücre iletişimi analizini ve özel bir Python Dash uygulaması kullanılarak etkileşimli ilgi alanı (ROI) seçimini uygular. Betik tabanlı yürütmeye, açık parametre gerekçelerine, beklenen çıktılara ve sorun giderme kontrol noktalarına vurgu yapan bu protokol, veri setine ve platforma özgü parametre değerlendirmesinden sonra, standart dizi tabanlı ST veri setleri ve ilgili platformlar için uyarlanabilir bir çerçeve sağlar.

İş akışının uygulanması ve veri entegrasyonu, temel doku özelliklerini örneklendirmektedir
Hesaplama iş akışı, analitik aşamalar boyunca beklenen çıktıları örneklendirmek için fare kolon mekansal transkriptomik verilerine uygulanmıştır. İş akışı şemasında (Şekil 1) gösterildiği gibi, boru hattı, mekansal özellik grafiklerinin doku sınırlarını belirlediği veri edinimi ve kalite kontrolü ile başlamıştır (Şekil 2A,B). Ardından, yorumlanabilir biyolojik varyasyonu korurken teknik grup etkilerini azaltmak için Seurat'nin çapa tabanlı entegrasyon iş akışı kullanılmıştır. UMAP görselleştirmeleri, entegrasyon sonrası örnek hizalamasını ve mekansal kümeleme modellerini göstermiştir (Şekil 2C,D). Boyut indirgemeye ve sonraki kümeleme işlemlerine rehberlik etmek amacıyla, kümülatif varyansa dayalı temel bileşenlerin (PC'ler) kantitatif ve dinamik seçimi uygulanmıştır (bkz. Ek Şekil 1). Markör gen ısı haritası analizi, mekansal kümelerin temelini oluşturan belirgin transkripsiyonel profilleri göstermiştir (Şekil 2E).
Hesaplamalı kümelerin kolon histolojisinin bilinen anatomik mimarisiyle uyumlu olup olmadığını değerlendirmek için, kanonik tabaka spesifik belirteç genlerin ekspresyon profilleri incelenmiştir. Mukozal epitel tabakası, goblet hücre belirteci Muc2'nin yanı sıra Epcam ve Krt8 dahil olmak üzere epitel hücre belirteçlerinin ekspresyonunu göstermiştir. Col1a1 ve Vim gibi mezenkimal ve stromal belirteçler lamina propria ve submukozal bölgeleri işaretlemiş, dış muscularis propria tabakası ise Acta2 ve Tagln gibi düz kas yapısal genleri tarafından belirtilmiştir. Bu soy hattı ilişkili belirteçlerin uzaysal kısıtlılığı, entegrasyon ve kümeleme iş akışının, kolon dokusunun mukozal-muscularis ekseni boyunca temel histolojik laminasyonlarını koruduğu yorumunu desteklemektedir (bakınız Ek Şekil 2).
Küme doğrulamasının ardından, deneysel koşullar arasındaki diferansiyel olarak ifade edilen genleri (DEG'ler) belirlemek için aşağı akış diferansiyel ekspresyon analizi gerçekleştirilmiştir (Şekil 2F,G). Ayrıca, doku boyunca anlamlı ve rastgele olmayan mekânsal dağılıma sahip genleri vurgulamak amacıyla Moran's I istatistiği kullanılarak mekânsal olarak değişken genler belirlenmiştir (Şekil 2H).
Hücresel dekonvolüsyon ve mekansal etkileşim ağları doku mikroorganizasyonunu ortaya çıkarır
Tek hücreli RNA-seq referans verilerinin işlenmesi; QC filtrelemesi (Şekil 3A), denetimsiz kümeleme (Şekil 3B), belirteç gen doğrulaması (Şekil 3C) ve bağımsız anotasyonlarla uyumluluk (Şekil 3D) ile desteklenen anotasyonlar sağlamıştır. Hücresel kompozisyon (Şekil 3E), dekonvolüsyon için alt örnekleme stratejisine temel oluşturmuştur. SPOTlight, uzaysal spotlar genelinde referans kılavuzlu hücre tipi oranlarını tahmin ederken (Şekil 4A,B), STdeconvolve uzaysal hücresel paternlerin denetimsiz bir konu modelleme görünümünü sunmuştur (Şekil 5B). Özel Select Spatial Spots aracı, bu paternler için histolojik bağlam sağlamıştır (Şekil 5A). Son olarak, dekonvolüye edilmiş hücre tipi atamaları kullanılarak yapılan uzaysal iletişim analizi, uzaysal olarak yakın hücre tipi grupları arasındaki ligand-reseptör etkileşimlerini tanımlamıştır (Şekil 6A,B).
Protokol optimizasyonundan elde edilen sorun giderme gözlemleri
Protokol optimizasyonu sırasında, pratik kontrol noktalarına temel oluşturan çeşitli sorunlar tespit edilmiştir. Tek hücre referansları doku bağlamıyla zayıf şekilde eşleştiğinde suboptimal dekonvolüsyon sonuçları meydana gelmiştir; bu durum, mevcut olduğunda doku ve türe uygun scRNA-seq verilerinin kullanılması gerektiğini göstermektedir. Varsayılan parametrelerle yapılan ilk kümeleme denemeleri, beklenen biyolojik yapıları her zaman çözümleyememiştir; PC seçiminin, kümeleme çözünürlüğünün ve marker gen tutarlılığının incelenmesi, doku anatomisiyle uyumlu, mekansal olarak yorumlanabilir alanların tanımlanmasına yardımcı olmuştur. Bu gözlemler, kullanıcıların iş akışının yürütülmesi sırasında yaygın analitik sorunları nasıl teşhis edebileceklerine dair pratik örnekler sunmaktadır.
<img alt="scRNA-seq veri analizi iş akış şeması. İşlemler: normalizasyon, entegrasyon, kümeleme." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Şekil 1"> 
Şekil 1Entegre uzamsal transkriptomik analizi için iş akışı. Veri elde etme ve ön işlemeden gelişmiş uzamsal analizlere kadar olan analitik iş akışının şematik gösterimi. Temel adımlar şunlardır: (1) Seurat kullanılarak verilerin yüklenmesi, kalite kontrolü ve çoklu örnek entegrasyonu; (2) Uzamsal kümeleme ve uzamsal olarak değişken genlerin tespiti; (3) Hücre tipi dekonvolüsyonu aracılığıyla referans tabanlı (SPOTlight) ve gözetimsiz (STdeconvolve) yöntemler; (4) Giotto ile mekânsal hücre-hücre etkileşimi analizi ve özel bir araç kullanılarak etkileşimli ilgi alanı seçimi, Uzamsal Spotların SeçimiTüm modüllerden elde edilen sonuçlar, doku mimarisi ve hücresel mikroçevreye ilişkin biyolojik çıkarımlar yapmak amacıyla sentezlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig1large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Keman grafikleri, t-SNE kümelemesi, yanardağ grafiği ve ısı haritası verileri ile uzamsal transkriptomik analizi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Şekil 2"> 
Şekil 2Veri entegrasyonu, kümeleme ve diferansiyel ekspresyon analizi. (A,B) Gen sayıları, UMI sayıları ve mitokondriyal gen yüzdelerinin dağılımlarını gösteren, A1 ve B1 uzamsal örnekleri için kalite kontrol metrikleri. (C) Entegre edilmiş uzamsal transkriptomik verilerin, örnek kaynağına (sol) ve kümeleme kimliğine (sağ) göre renklendirilmiş UMAP görselleştirmesi. (D) Küme kimliklerinin doku kesitleri üzerine uzamsal projeksiyonu. (E) Her bir mekânsal küme için en üst sıralardaki marker genlerin ısı haritası. (F) A1_colon_d0 ve B1_colon_d14 koşulları arasında farklı şekilde eksprese edilen genleri gösteren yanardağ (volcano) grafiği. (G) Temsili diferansiyel eksprese genlerin doku kesitleri boyunca uzamsal ekspresyon paternleri. (H) Tanımlanan en yüksek mekansal değişkenlik gösteren genlerin mekansal ekspresyon haritaları aracılığıyla Sol iki panelin A1_colon_d0 örneğinden gelen genleri, sağ iki panelin ise B1_colon_d14 örneğinden gelen genleri gösterdiği Moran's I istatistiği. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig2large.jpg" target="_blank">Lütfen bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayın.</a>
<img alt="scRNA-seq analizi: keman grafikleri, UMAP kümeleri, hücre tipi skorları ve sütun grafiği dağılımı." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Şekil 3"> 
Şekil 3: Tek hücre referans veri işleme ve anotasyon. (A) Filtreleme öncesi ve sonrası scRNA-seq referans verileri için kalite kontrol metrikleri. (B) Denetimsiz kümelere göre renklendirilmiş scRNA-seq verilerinin UMAP görselleştirmesi. (C) Kümeler genelinde kanonik hücre tipi marker genlerinin ekspresyon skorlarını gösteren nokta grafiği. (D) Temel hücre tiplerinin etiketlendiği scRNA-seq verilerinin anotasyonlu UMAP görselleştirmesi. (E) scRNA-seq referans veri setinin hücresel kompozisyonu. Kesikli kırmızı çizgi, hesaplama verimliliği ile hücre tipi temsiliyetini dengelemek için SPOTlight dekonvolüsyonu sırasında uygulanan alt örnekleme eşiğini (tip başına n = 50 hücre) göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig3large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Hücre tipi dağılımı, mikroskopi görüntüleri; dokularda B hücresi, endotelyal, fibroblast analizi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Şekil 4"> 
Şekil 4: Hücresel heterojenliğin uzamsal dekonvolüsyonu. (A,B) A1 (A) ve B1 (B) örnekleri için her bir spotta ana hücre tiplerinin oransal kompozisyonunu gösteren SPOTlight dekonvolüsyonundan elde edilen uzamsal scatterpie grafikleri. (C) A1 (solda) ve B1 (sağda) örneklerinde B hücrelerinin temsili uzamsal dağılımı; dekonvolüsyon yoluyla tanımlanan belirli bir bağışıklık hücresi popülasyonunun uzamsal olarak çözümlenmiş lokalizasyon paternlerini göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig4large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Uzaysal gen ekspresyon analizi, doku kesitindeki hücre tiplerini ve piksel gruplarını gösteren diyagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Şekil 5"> 
Şekil 5: İnteraktif ilgi alanı analizi ve gözetimsiz dekonvolüsyon karşılaştırması. (A) Proksimal kolon, distal kolon ve diğer doku alanlarına karşılık gelen bölgelerin interaktif seçimini gösteren özel "Uzaysal Noktaları Seç" (Select Spatial Spots) aracı arayüzü. (B) A1 örneği için gözetimsiz dekonvolüsyon (STdeconvolve) sonuçlarının uzaysal scatterpie görselleştirmesi; noktalar (A) kısmındaki manuel olarak not edilmiş bölgelere göre renklendirilmiş olup, histoloji tabanlı notasyon ile bilgisayarlı olarak türetilen hücre konu dağılımları arasındaki uygunluğu göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig5large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Ligand-reseptör etkileşimleri ve log2fc değerlerini içeren hücre-hücre iletişimi şeması; kabarcık diyagramı." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Şekil 6"> 
Şekil 6: Mekansal olarak bilgilendirilmiş hücre-hücre iletişim ağları. (A,B) A1 (A) ve B1 (B) örnekleri için Giotto tarafından çıkarılan ligand-reseptör etkileşim ağları. Düğümler hücre tiplerini, kenarlar anlamlı ligand-reseptör çiftlerini (FDR &lt; 0.05) temsil eder ve kenar kalınlığı etkileşim gücüne karşılık gelir. Karşılaştırılabilirliği ve görselleştirme netliğini sağlamak için tüm örneklere tek tip bir anlamlılık eşiği (FDR &lt; 0.05) uygulanmış ve her koşul için log2FC'ye göre sıralanan ilk 20 etkileşim görüntülenmiştir. Ağlar, kolon dokusunun mekansal bağlamı içindeki hücre tipine özgü iletişim modellerini vurgulamaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig6large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: Boyut indirgeme için parametre optimizasyonunun nicel değerlendirmesi.Dirsek grafiği, optimal temel bileşen (PC) sayısını dinamik olarak seçmek için iş akışının programmatik yaklaşımını göstermektedir. Seçim, downstream kümeleme öncesinde teknik gürültüyü azaltırken biyolojik varyansı yakalamak amacıyla, kırmızı dikey çizgi ile temsil edilen kümülatif standart sapma ve marjinal varyans eşiklerine dayanarak hesaplanmıştır.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/FigureS1.tif" target="_blank">Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 2: Kanonik kolon tabakasına özgü markörler kullanılarak uzamsal kümelemenin doğrulanması. (A) Hesaplamalı kümeler genelinde epitelyal, stromal ve düz kas markörlerinin zenginleşmiş ekspresyonunu gösteren nokta grafiği. (B) Temsili markörlerin (Epcam, Col1a1, Acta2) doku koordinatlarına geri eşlendiği uzamsal özellik grafikleri.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/FigureS2.tif" target="_blank">Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, kamuya açık veri edinimi ve Seurat tabanlı kalite kontrolden başlayarak entegrasyon, mekânsal özellik tespiti, hücre tipi dekonvolsiyonu, ilgi bölgesi anotasyonu ve hücre-hücre iletişimi analizine kadar uzanan, şeffaf yürütmeyi destekleyen pratik kontrol noktalarıyla birlikte, mekânsal transkriptomik verilerin analizi için tekrarlanabilir bir iş akışı sunmaktadır.

Siyasal Transkriptomik Veri Analizi İçin Pratik Bir İş Akışı: Veri Eldesinden İleri Analizlere

Uzamsal transkriptomik (ST), doku içindeki mRNA moleküllerinin iki boyutlu uzamsal bağlamını korurken genom genelindeki gen ekspresyonunu profiller...

Herkese merhaba. Bu videoda, veri edinimi ve yüklemeden temel keşfe ve nihayetinde ileri analize kadar uzanan pratik bir uzamsal transkriptomik veri analizi hattını inceleyeceğiz. Genel olarak iş akışı üç ana adımdan oluşmaktadır.İlk olarak verilerin indirilmesi, ikinci olarak analiz kodunun temin edilmesi ve üçüncü olarak sonuçları oluşturmak için iş akışının çalıştırılması. Birinci adım, veri edinimi ve dizin yapısının hazırlanması. İlk olarak, halka açık konumsal transkriptomik veri setlerini temin edin.Ham veri arşivini indirin. Ardından arşivi dışa aktarın. Dosyaları standartlaştırılmış bir dizin yapısında düzenleyin.Öncelikle ana bir veri dizini oluşturun ve ardından her örnek için özel bir alt dizin oluşturun. Her örnek için gerekli olan aşağıdaki temel dosyaları ilgili alt dizine aktarın. Son olarak, her örnek dizini içinde bir spatial alt klasörü oluşturun.Aşağıdaki dosyaları spatial alt klasörüne yerleştirin. Filtrelenmiş özellik PC metrikleri S1 dosyasını örneğin ana alt dizinine yerleştirin. Spatial klasöründeki gzip dosyalarınıle basınçtan çıkarın.Orijinal dosya adlarının load 10X spatial fonksiyonunun gereksinimlerine uygun şekilde kaldığından emin olun. İkinci adım, yazılım ortamının kurulumudur. Burada R dilinin kurulumu atlanmıştır ve veri işleme süreci, GitHub deposundaki analiz betiğinin alınmasıyla başlar.Dosya iletkenindeki Graham'dan gerekli R paketlerini setup R betiğini çalıştırarak yükleyin. Resmi belge sayfasında verilen kurulum komutlarını çalıştırarak auto suit'i kurun. Kurulum betiklerini almak için resmi kurulum URL'sine gidin. Kurulum sayfası talimatlarına göre gerekli Python ortamını ve sistem bağımlılıklarını başlatın.GitHub deposuna giderek özel aracı edinin ve kaynak kodunu indirin. TOS dizinine gidin ve Python bağımlılıklarını yükleyin. Üçüncü adım, mekansal veri yükleme ve kalite kontrolüdür.Uzamsal verileri Seurat nesnesine aktarın. Yüksek çözünürlüklü doku görüntüsünü manuel olarak yüklemek için read 10X image fonksiyonunu kullanın. Burada görüntüyü ve görüntü adını belirtin.Görüntü parametresi önceki adımda oluşturulan görüntü nesnesine ayarlanmış şekilde load 10X spatial fonksiyonunu kullanın ve Seurat nesnesini oluşturun. Kalite kontrol metriklerini hesaplayın. mt. deseniyle tanımlanan percentage feature set kullanarak mitokondriyal okuma yüzdesini hesaplayın.Verileri QC metriklerine dayanarak görselleştirin ve yorumlayın. Violin plot fonksiyonunu kullanarak nCount_Spatial, nFeature_Spatial ve percent.mt için keman grafikleri oluşturun.Bu metriklerin mekansal özellik grafiklerini oluşturmak için mekansal özellik grafiklerini kullanın. Ve doku alanının dışındaki spotları belirleyin. İsteğe bağlı olarak, düşük kaliteli spotları çıkarmak için filtreler uygulayın.Betik çalıştırıldıktan sonra, QC metrikleri ve özellik uzamsal grafiği dahil olmak üzere bu sonuçları elde edebilirsiniz. Dördüncü adım; veri ön işleme, entegrasyon ve kümeleme. Bireysel örneklerin ön işlemesinde normalizasyon yapın.Spatial analizi ile her bir örneğe ayrı ayrı SC transform normalizasyonu uygulayın. Birden fazla örneği entegre edin. Entegrasyon için SCTransform ile normalize edilmiş nesnelerin listesini hazırlayın.Uzamsal analizi kopyalayarak her nesnenin bir RNA analizi olduğundan emin olun. Paylaşılan değişken özellikleri belirlemek için PREP SCT entegrasyonundaki seçilmiş entegrasyon özelliklerini kullanın. Normalizasyon yöntemi SCT olan find integration anchors ile entegrasyon çapalarını bulun.Verileri IntegrateData kullanarak entegre edin. Entegre edilmiş analiz üzerinde kümeleme için boyut indirgeme işlemini gerçekleştirin. runPCA kullanarak entegre edilmiş veriler üzerinde PCA çalıştırın.Kümülatif açıklanan varyansı hesaplayarak, sonraki analizler için optimal temel bileşen sayısını belirleyin. Dirsek noktasını program aracılığıyla tespit edin. Belirlenen temel bileşen (PC) sayısını kullanarak UMap çalıştırın.FindNeighbors ve FindClusters kullanarak hücreleri kümeleyin. Belirlenen PC'leri 0,5 çözünürlük ayarıyla belirtin. FindWorkers fonksiyonunu kullanarak hedef gruplar arasında diferansiyel ekspresyon analizi gerçekleştirin.Uzamsal olarak değişken genleri belirleyin. Her bir orijinal örnek için, uzamsal otokorelasyonu hesaplamak amacıyla SCT testi üzerinde Moran's I yöntemini kullanarak uzamsal olarak değişken özellikler belirleme işlemini (find spatially variable features) çalıştırın. Bu betiği çalıştırdıktan sonra; dirsek grafiğini (elbow plot), UMap grafiğini, küme grafiğini, küme belirteçleri ısı haritasını, yanardağ grafiğini (volcano plot), uzamsal özellik olarak farklı ifade edilen genleri, uzamsal olarak güvenilir genleri ve kolon tabakası belirteçlerini elde edebilirsiniz.Kolon tabakası belirteçlerinin nokta grafiği ve mekansal özellik grafiğindeki belirteçler. Beşinci adım, tek hücre referans veri ön işlemesi. read 10X kullanarak tek hücre RNA-seq sayım matrisini okuyun ve bir Seurat nesnesi oluşturun.Standart QC normalizasyonu ve küme ayıklama (declustering) işlemlerini gerçekleştirin. Filtrelenen hücrelerdeki mitokondriyal okuma yüzdesini hesaplayın. Verileri SC transform kullanarak normalize edin.Bir vara.to. belirleyin, percent.mt değerini regrese edin. Long PCA UMap uygulayın ve hücreleri önceki adımlarda açıklanan dinamik PC seçim yöntemini kullanarak kümeleyin, ardından hücre tiplerini açıklayın.AddModuleScore kullanarak kanonik hücre tipi belirteç genleri için modül skorlarını hesaplayın. Kümeleri, modül skorlarına ve bilinen biyolojik verilere göre tanımlayın. Alternatif olarak, önceden hesaplanmış tanımlamaları metadata üzerinden içe aktarın.Bu betiği öğrendikten sonra, QC metriklerini elde edebilirsiniz. Kümelere göre UMap, örneklere göre UMap ve hücre tipi skorlarını yüklemişlerdir. Altıncı adım, SPOTlight ile referans kılavuzlu dekonvolüsyon işlemidir.İlk olarak, SPOTlight için verileri hazırlayın. Açıklamalı tek hücreli Seurat nesnesini ve mekansal Seurat nesnesini tek hücreli deney nesnesine dönüştürün. Tek hücreli verileri LogMoreCounts kullanarak log-normalize edin.Ardından SPOTlight dekonvolüsyonunu çalıştırın. İlk olarak, ModelGeneVar kullanarak tek hücreli veriler üzerindeki yüksek değişkenli genleri belirleyin. Skor belirteçlerini kullanarak hücre tipi belirteçlerini hesaplayın ve yüksek kaliteli belirteçler için filtreleme yapın.Hesaplama süresini azaltmak için her hücre tipi için tek hücre referansını yönetilebilir bir sayıya düşürün. Tek hücre referansını, mekansal verileri, işaretleyici listesini ve HVG'leri sağlayarak SPOTlight fonksiyonu ile dekonvolüsyonu gerçekleştirin; ardından sonuçları görselleştirebilir ve dışa aktarabiliriz. Dekonvolüsyon sonucunu, bir scatter pipe route olarak gösterilen şu şekilde elde edebilirsiniz.Yedinci adım, Stdeconvolve ile denetimsiz dekonvolüsyon. Öncelikle uzamsal verileri hazırlayın. Uzamsal Seurat nesnesinden, counts slot'u ile GetAssayData kullanarak satır sayısı metriklerini çıkarın.STdeconvolve'dan elde edilen temiz sayımlar kullanılarak düşük kaliteli spotlar ve genler temizlenir. Corpus, fitLDA kullanılarak bir dizi potansiyel konu sayısı üzerinden tahsis modeline ulaşan restrict strict LDA ile spotların minimum bir fraksiyonunda ifade edilen dört geni kullanarak filtreler için gizli hücre tiplerini tanımlar. opt min ile optimal model kullanılarak minimum karmaşıklığa dayalı olarak en uygun model seçilir.Sonuçları analiz edin ve görselleştirin. Optimal model için serotip oranını (Theta) ve gen profillerini (Beta) getBetaTheta kullanarak çıkarın. Korozyon konularının biyolojik yorumunu eklemek için, seçili mekansal nokta (select spatial spot) aracıyla oluşturulan ilgi alanı anotasyonlarını içe aktarın.Bu notasyonları "all topics" fonksiyonunda grubun parametresi olarak kullanın. Dekonvolüye edilmiş hücre tipi oranlarını projenizin uzamsal koordinatlarına geri aktarın ve spotları ROI'lerine göre renk kodlayın. Betiği çalıştırdıktan sonra, SPOTlight tarafından üretilenlere benzer şekilde, bir ölçek boru yüklemesi gibi şu sonucu elde edeceksiniz.Sekizinci adım, Giotto kullanılarak gerçekleştirilen mekansal hücre-hücre iletişimi. Öncelikle, Seurat nesnesini bir Giotto nesnesine dönüştürün. Düşük sayım metriklerini ve mekansal koordinatları sağlayarak createGiottoObject fonksiyonunu kullanın.Giotto nesnesini ön işlemeden geçirin ve dekonvolüsyon sonucunu ekleyin. Verileri normalize edilmiş Giotto kullanarak normalize edin ve serotip anotasyonları olarak ekleyin. addCellmetadata kullanarak hücre meta verilerini seçin.createSpatialNetwork kullanarak mekansal ağ oluşturun. Ortamımıza bir ligand reseptör veri tabanı yükleyin. Hücre tipleri arasındaki mekansal yakınlıkta bulunan anlamlı ligand reseptör etkileşimlerini belirlemek için explore CellCellcom komutunu çalıştırın.Hücre-hücre etkileşimi nokta grafiğini bu şekilde elde edebilirsiniz. Dokuzuncu adım isteğe bağlıdır. SelectSpatialSpot ile etkileşimli nokta seçimi.six betiğini kullanarak etkileşimli araç için verileri hazırlayın. GetTissueCoordinates kullanarak Seurat nesnesinden uzamsal koordinatları çıkarın. Verileri biçimlendirin ve dışa aktarın.Oluşturulan veri çerçevesini bir CSV dosyasına aktarın. Ardından ilgi alanı analizi gerçekleştirin. Özel uygulamayı başlatın.Spatial spots dash uygulamalarını seçin ve CSV dosyasını yükleyin. Konumsal konuma göre noktaları etkileşimli olarak seçin. Ardından, seçilen noktaların listesini ve atanan gruplarını yeni bir CSV dosyası olarak dışa aktarın.Betiği sırasıyla çalıştırdıktan sonra neler elde edebileceğimizi kontrol ediyoruz. Tüm sonuçlar "results five-fold" klasörüne kaydedilir. Gördüğünüz üzere, QC metriklerini elde edebilir ve bunları bölebiliriz.Mekansal özellik grafiğini buradan kontrol edebilirsiniz. Ayrıca, dekonvolüsyon işlemi hem denetimli hem de denetimsiz yöntemlerle gerçekleştirilmiştir. SPOTlight sonuçları burada yer almaktadır.Gördüğünüz gibi, tüm noktalar oran bilgilerini içermektedir. STdeconvolve ile elde edilen gözetimsiz dekonvolüsyon sonuçları da burada oluşturulmuştur. Bu ise mekânsal verideki noktanın Seurat kümeleme sonucudur.Bunları, şu şekilde, mekansal ekip grafiğinde de görselleştirebilirsiniz. Dahası, Giotto ile nokta-nokta etkileşimi sonucunu da elde edebilirsiniz. Bu iş akışının tamamı %100 açık kaynaktır.Ekspresyon metriklerinden gelişmiş uzamsal modellemeye kadar noktalama analizi. Tüm adımlar 16GB RAM'e sahip bir makinede çalıştırılmaktadır. Kod tabanı modülerdir; her görev için bir betik bulunmaktadır.Bu iş akışının, FASTQ dosyalarından başlayan ön işleme aşamalarını kapsamadığını unutmayın. Odak noktası 2D mekânsal verilerdir ve şu an için yalnızca Visium'un indiricilerini içermektedir. Hepsi bu kadar, izlediğiniz için teşekkürler.

a-practical-workflow-for-spatial-transcriptomics-data-analysis-from

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Onkojenik füzyon transkripsiyon faktörü fonksiyonu için özünde düzensiz alan adları önemlidir. Bu proteinleri terapötik olarak hedeflemek için, bu alanlar tarafından kullanılan düzenleyici mekanizmaların daha ayrıntılı bir şekilde anlaşılması gerekir. Burada, Ewing sarkomunda özünde düzensiz olan EWS alanının önemli yapısal özelliklerini haritalamak için transkriptomik kullanıyoruz.

Transcriptomik Analiz Kullanarak Düzensiz Onkojenik Transkripsiyon Faktörlerinin Yapı-fonksiyon İlişkilerinin Eşlenmesini

Burada, tümör mikro ortamını daha iyi karakterize etmek ve spesifik hücre popülasyonlarını tanımlamak için Spatial Omics teknolojileri için ilgi çekici bölgelere (ROI'ler) ince ayar yapmak için bir protokol açıklıyoruz. Proteomik testler için, otomatik özelleştirilmiş protokoller ROI seçimine rehberlik edebilirken, transkriptomik tahliller 50 μm kadar küçük ROI'ler kullanılarak ince ayarlanabilir.

Dokuda Protein ve RNA Ekspresyonunun Uzamsal Profillemesi: Sanal Mikrodiseksiyona İnce Ayar Yapmaya Bir Yaklaşım

Burada, birden fazla Zebra Balığı (Danio rerio) larva örneğini hizalamak ve kriyoseksiyona tabi tutmak ve bunları mekansal transkriptomik analiz için tek bir slaytta toplamak için bir yöntem sunuyoruz.

Mekansal transkriptomik analiz için larva zebra balığı bölümlerinin mekansal olarak kompakt düzenlenmesi

Bu makale, doku mimarisini korurken çeşitli transkriptomların yüksek çözünürlüklü haritalanmasını sağlayan Stereo-seq kullanarak formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku bölümlerinden konakçı, viral, fungal ve mikrobiyom RNA'sının kapsamlı uzamsal transkriptomik profilini çıkarmak için bir protokol sunmaktadır.

Stereo-seq ile Türden Bağımsız Transkriptomların Kapsamlı Uzamsal Profili

Bu makale, uzamsal transkriptomik için dinamik, etkileşimli bir veritabanı olan DeepSpaceDB'yi kullanmak için bir protokol sunar ve doku organizasyonunu ve hastalıkla ilgili gen ekspresyonunu keşfetmek için analiz iş akışları ve örnekler sunar.

DeepSpaceDB kullanarak Uzamsal Transkriptomik Veri Kümelerinin Madenciliği

Bu protokol, kalsifikasyon olmuş damar örnekleri için adım adım bir iş akışı içerir: doku işleme, kalsifikasyon giderilmesi, RNA doğrulama, kalsifikasyon seviyesi tespiti ve Nanostring GeoMx Dijital Mekansal Profiler (DSP) üzerinde ilgi alanı seçim stratejileri. Amaç, güvenilir mekansal transkriptomik analiz için damar dokusu morfolojisi ve RNA'nın korunmasına yönelik kapsamlı bir yöntem sunmaktır.

Dijital Mekansal Profilleme için Korunmuş Morfoloji ve RNA ile Kalsifikasyon Arter Hazırlanması ve İşleme

Bu çalışma, bir doku kesitinin doğrudan uzamsal barkodlamasını tek hücreli çoklu analiz ile birleştiren bir uzamsal Trekker–CUT&amp;Tag çoklu protokolü sunmaktadır. Bu yaklaşım, gen ekspresyonunun ve histon H3K27ac modifikasyonunun aynı anda mekansal olarak çözülen tek hücreli profillenmesini sağlar ve doku mikroanatomisi bağlamında gen düzenlemesine mekanik içgörüler sunar.

Donmuş doku kesitlerinde transkriptom ve epigenomik hedeflerin mekansal çözülmüş, entegre tek hücreli multiomik profillenmesi

Tandem birleştirme olayları, birbirinden 12 nükleotidden daha az uzaklıkta meydana gelir. Bu tür ek varyantlarının oranlarının niceliksel olarak belirlenmesi, mutlak bir kantitatif PCR yaklaşımı kullanılarak mümkündür. Bu el yazması, iki birleştirme olayının Serine-701 dahil etme/dışlama ve α/β C-uçları ile sonuçlandığı STAT3 geninin ek varyantlarının nasıl ölçülebileceğini açıklamaktadır.

Mutlak ve Bağıl Kantitatif PCR Veri birleştirme STAT3 Splice Varyant Dökümünü belirlememize

Galaxy ve DAVID biyoinformatik eğitim olmadan araştırmacılar analiz etmek ve RNA-Seq verileri yorumlamak için izin popüler araçlar olarak ortaya çıkmıştır. C. elegans araştırmacılar RNA-Seq deneyler, erişimi gerçekleştirmek ve Galaxy kullanarak veri kümesi işlemek ve DAVID kullanarak gen listelerinden anlamlı biyolojik bilgi elde etmek için biz bir protokol açıklar.

arasında Transkriptomik Analizi<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</emGalaxy Projesi Smokin Suite sayesinde&gt; RNA Sıralama Veri

Bu el yazması, aynı anda yukarı akış ve aşağı akış vektör-konakçı bağlantı DNA'sını analiz edebilen çift yönlü bir entegrasyon alanı tahlilinin deneysel prosedürünü ve yazılım analizini anlatmaktadır. Çift yönlü PCR ürünleri, herhangi bir aşağı akım sıralama platformu için kullanılabilir. Ortaya çıkan veriler, entegre DNA hedeflerinin yüksek verimli, niceliksel bir karşılaştırması için kullanışlıdır.

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University.  This protocol presents a reproducible workflow for analyzing spatial transcriptomics data, guiding users from public data acquisition and Seurat-based quality control through integration, spatial feature detection, cell-type deconvolution, region-of-interest annotation, and cell–cell communication analysis, with practical checkpoints that support transparent execution.

Siyasal Transkriptomik Veri Analizi İçin Pratik Bir İş Akışı: Veri Eldesinden İleri Analizlere

Daha fazla video keşfet