Gen Taşımayı Artırmak İçin Mezenkimal Kök Hücre Zarı Zarflı Nanoveziküllerin Geliştirilmesi
17 Şubat 2026
Bu protokol, gen tedavisi için mezenkimal kök hücre (MSC) türevli ekstraselülük vezikül biyomimetiklerinin üretilmesi ve saflaştırılması için bir yöntem tanıtmayı amaçlamaktadır. Nanovezikül, MSC'den türetilen lipid çift katmanlarla sınırlıdır ve lümende ilgi çekici geni taşıyan rekombinant AAV'leri kapsüller. Bu nanovezikül, in vivo gen taşıması için gelişmiş bir vektör sunar.
Bu protokolde, ekstrasellüler veziküllere benzeyen mezenkimal kök hücre türevli nanoveziküllerin hazırlanması ve daha iyi gen taşıması için AAV'leri kapsüllemesi için bir yöntem tanıtıyoruz. Buna AAV içeren nanoveziküller CME-AAV diyoruz. Gelişmekte olan gen taşıma vektörü EV-AAV ile karşılaştırıldığında, CME-AAV'ler hücre kaynaklarında daha fazla esneklik ve daha yüksek verim sunar.
Başlamak için, kültür ortamını, insan mezenkimal kök hücreleri içeren bir kültür kabından %70 ila 90 birleşimde çıkarın. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, hücreleri kültür kabından ayırın ve PBS içeren konik bir tüpe aktarın. Toplanan hücreleri 300g sıcaklığında beş dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüjlenerek hücreleri pellet et.
Sonra hücre pelletini PBS ile iki kez yıkayın ve tekrar santrifüj yapın. Son hücre pelletini PBS'de bir proteaz inhibitörü kokteyli ile takviye edilmiş şekilde yeniden süzülür. Daha sonra, hücre süspansiyonunu plazma zarını bozmak ve ham bir lizat oluşturmak için üç donma-erime döngüsüne tabi tutar.
Bir pipet kullanarak lizatı iyice homojenleştirin. Sonra, hücresel kalıntıları çıkarmak için 1.000g ile 20 dakika boyunca dört derece Celsius sıcaklığında santrifüj yapın. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.
18.000g sıcaklığında dört derece Celsius'ta bir saat boyunca santrifüj yapın, membran fraksiyonu pellet edilir. Üst maddeyi atıp PBS içindeki membran pelletini yeniden süspansiyona yerleştirerek ham mezenkimal kök hücre membran fraksiyonu elde edilir. Şimdi, membran askısını 20 ila 27 gauge iğnelerle donatılmış şırıngalardan sıralı olarak geçirerek homojenleştirin.
Homojenize membran süspansiyonunun protein konsantrasyonunu bisinkoninik asit testi kullanarak belirleyin. Süspansiyonu alıp ihtiyaç duyulana kadar -80 derece sıcaklıkta sakla. Her çözülme döngüsünden sonra süspansiyonu 27 gauge bir şırınga ile yeniden homojenleştirin.
Hazırlanan zar süspansiyonu, adeno-ilişkili virüs (AAV) ile 10 genom kopyasının gücüne 150 mikrogram protein oranında karıştırın. Karışımı 37 derece Celsius'ta 30 dakika boyunca nazikçe çalkalayarak inkübe yapın. Zar ve virüs karışımını, 400 nanometrelik polikarbonat zarla donatılmış mini ekstrudere yükleyin.
Karışımı ekstruderden 20 kez geçirerek kapsülasyonu teşvik edin. 400 nanometrelik zarı 200 nanometrelik bir zarla değiştirin ve ekstrüzyonu tekrarlayın. Kapsüllü virüs içeren süreç süspansiyonu, kapsüllenmemiş virüs ve boş vezikülleri toplayın.
Gerekirse birden fazla parti toplayın ve hemen arındırmaya geçin. Stok iyodiksanol çözeltisini 10x PBS ve steril deiyonize su ile seyreltirerek %40 ve %25 çözelti elde edin. Pipet kullanarak, 13,2 mililitrelik açık üst ince duvarlı ultra şeffaf tüpün altına %40 iyodiksanol ekleyin.
Sonra, %40 tabakanın üzerine üç mililitre %25 iyodiksanol sererek kesintisiz bir gradyan oluşturun. İşlenen süspansiyondan yedi mililitreyi nazikçe gradyanın üstüne yerleştirin. Tüpleri dengeleyin ve onları salıncak kovalı ultrasantrifüj rotoruna yükleyin.
150.000g sıcaklığında üç saat boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın, hızlı ivme ve yavaş yavaşlama kullanarak. Sonra, gradyanı bozmadan tüpleri dikkatlice çıkarın. Bir mililitrelik fraksiyonları yukarıdan aşağıya etiketli 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine toplayın.
Tüm kesirleri buzda tutun. Şimdi, saflaştırılmış CME-AAV'ları içeren yedi ve sekizinci fraksiyonları yeni açık üstlü ultrasantrifüj tüpüne biriktirin. PBS ile hacmi 11 mililitreye çıkarın.
Sonra bir mililitrelik pipetle nazikçe karıştırın. Hızlı ivme ve yavaşlama kullanarak, biriktirilen fraksiyonları 150.000g ile üç saat boyunca dört derece Celsius'ta santrifüjlen. Süpernatantı dikkatlice atın.
Pellet, istenen konsantrasyona bağlı olarak 50 ila 200 mikrolitre steril PBS ile yeniden askıya alın. Aliquot, arındırılmış hazırlık. Sonra, daha fazla kullanıma kadar 80 derece Celsius'ta saklayın.
Kapsüllü virüs ve kontrol virüsünün steril PBS'de çalışma çözeltilerini hazırlamak. Her kuyunun kültür ortamına kapsüllenmiş virüsün veya kontrol virüsünün eşit genom kopyalarını doğrudan ekleyin. PBS veya boş virüs parçacıklarının eşdeğer hacmi olan negatif kontrol kuyularını ekleyin.
Plakayı nazikçe döndürerek eşit dağılımı sağlayın ve deneysel tasarıma bağlı olarak 24 ila 72 saat kuluçka yapın. Sonra, kültür ortamını nazikçe aspire edin. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayıp yerinden çıkarmadan.
Üreticinin talimatlarına göre Hoechst 33342 ile çekirdekleri boyamak. Gelişmiş yeşil floresan protein ve Hoechst için uygun filtre setleriyle ters floresans mikroskobu kullanarak canlı hücre floresans görüntüleme yapılacaktır. Gerekirse nicelik için 10x veya 20x objektif ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için 63x objektif seçin.
Aynı görüntüleme parametreleri kullanarak her kuyu başına en az beş görüş alanı edinin. Tüm görüntüleri nicel analiz için ham ve gri tonlu formatlarda kaydedin. Geçirim elektron mikroskopisi, CME-AAV'lerin boyut boyutları ve membrana bağlı yapılara benzeyen ekstraselüler veziküllere sahip olduğunu ortaya koydu.
Mezenkimal kök hücre zarı belirteçleri olan CD73 ve CD90, Western blot analiziyle CME-AAV'de tespit edildi. Üç ana adeno-ilişkili virüs kapsid proteini olan VP1, VP2 ve VP3, SDS-PAGE ile CME-AAV'de tanımlandı. NanoSight analizi CME-AAV9.
EGFP'nin ortalama çapı 128,6 nanometre ve toplam parçacık konsantrasyonu 1,32 kat 10 ile mililitrede 10 parçacık gücüne sahipti. Floresan mikroskopi, CME-AAV9'un ortaya çıktığını gösterdi. EGFP, HEK293T hücrelerde belirgin şekilde daha yüksek bir geliştirilmiş yeşil floresan protein ifadesi üretti.
Zar kaplamalı virüs, gen ifadesini yaklaşık 2,5 kat artırdı; bu da hücresel alımın arttığını ve potansiyel olarak hücre içi taşığın iyileşmesini göstermektedir. In vivo biyolüminesans görüntüleme, CME-AAV uygulamasından sonra karaciğerin en güçlü lüminesans sinyali gösterdiğini gösterdi. Karaciğer bölgelerinin nicel analizi, CME-AAV uygulamasının gen ekspresyonu seviyelerinin anlamlı şekilde arttığını ortaya koydu.
Bu protokoller, ekstrüzyon ve yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjasyonu yoluyla saflaştırılmış hücre zarı kaplamalı AAV'ler (CME-AAV) elde etme adımlarını açıklar. İki önemli faktör dikkatlice değerlendirilmesi gerekir: Ekstrüzyon için hücre parçalarının ön işlemesi ve CME-AAV parçacık-genom oranını kontrol etmek için membran parça-AAV karışım oranının optimize edilmesi. Gelecekteki çalışmalar, bağışıklık korumasını ve fonksiyonel yüzey özelliklerini artırmak için hücre zarı muhafazasını daha da inceleyebilir ve CME-AAV'yi AAV teslimatı için çok yönlü bir platform olarak optimize edebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Overview
Mesenchymal stem cell (MSC)-derived extracellular vesicles (EVs) are emerging as promising tools for therapeutic applications and regenerative medicine. This article introduces a novel platform utilizing MSC membrane-enveloped nanovesicles, generated via a size-defined extrusion method, to efficiently deliver gene therapy vectors. These engineered vesicles encapsulate recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors, offering improved gene delivery efficiency and production scalability compared to conventional approaches.
Key Study Components
Area of Science
- Gene therapy
- Regenerative medicine
- Stem cell biology
- Nanotechnology
Background
- Extracellular vesicles (EVs) are nanoscale vesicles secreted by all cell types, carrying proteins, RNAs, and metabolites.
- MSC-derived EVs have therapeutic potential due to their ability to modulate recipient cell behavior.
- Efficient DNA delivery via EVs is challenging due to poor DNA sorting mechanisms.
- Previous studies showed that AAV-containing EVs can deliver genes, but production is limited by low yield and time-consuming processes.
Purpose of Study
- To develop a scalable and efficient method for producing MSC membrane-enveloped nanovesicles for gene delivery.
- To encapsulate recombinant AAV vectors within these vesicles for enhanced gene transfer.
- To compare the efficiency and yield of this platform with conventional AAV and naturally secreted EV-AAVs.
Methods Used
- Generation of MSC membrane-enveloped nanovesicles using a size-defined extrusion technique.
- Encapsulation of recombinant AAV vectors carrying therapeutic gene sequences within the nanovesicles.
- Characterization of vesicle size (approximately 200 nm diameter) and properties.
- Comparison of gene delivery efficiency and production yield with conventional AAV and EV-AAVs.
Main Results
- The engineered MSC nanovesicles mimic natural EVs and efficiently encapsulate AAV vectors.
- These vesicles achieve significantly higher gene delivery efficiency compared to conventional AAVs.
- Production yield is greatly improved, with reduced time and cost relative to naturally secreted EV-AAVs.
- The platform supports scalable production suitable for clinical translation.
Conclusions
- The MSC-based membrane nanovesicle platform enhances gene delivery efficiency and scalability.
- This approach combines the advantages of EV-mimicking structures with AAV-mediated gene transfer.
- The technology offers a promising strategy to advance gene therapy toward clinical applications.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Efficient and scalable gene delivery remains a critical challenge in gene therapy and regenerative medicine pipelines. The development of mesenchymal stem cell (MSC) membrane-enveloped nanovesicles encapsulating recombinant AAV vectors addresses key bottlenecks in delivery efficiency and production yield. This platform offers enhanced predictive confidence for translational gene therapy programs and supports risk-adjusted portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene transfer mechanisms in disease-relevant cellular systems.
- Supports biological de-risking by mimicking natural extracellular vesicle properties.
- Facilitates functional validation of gene delivery targets with improved efficiency.
Screening & Assay Development
- Provides standardized nanovesicle preparations for reproducible gene delivery assays.
- Improves assay scalability and throughput by reducing production time and cost.
- Enables quantitative comparison of gene transfer efficiency across candidate vectors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by supporting sustained gene expression in vitro and in vivo.
- Bridges discovery and preclinical validation with scalable, EV-mimicking delivery vehicles.
- Reduces risk in advancing gene therapy candidates toward clinical translation.
Pipeline & Workflow Integration
This nanovesicle platform integrates from early discovery through preclinical gene therapy development, supporting both mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing for gene delivery and expression in MSC-derived systems.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative gene transfer outputs for candidate evaluation.
- Analytics: Enables measurement of delivery efficiency and yield for cross-condition comparison.
- Translational Research: Supports continuity from in vitro validation to in vivo preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for diverse gene therapy programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene delivery and target validation.
- Operational Value: Standardizes production and reduces time-to-assay for gene transfer studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital allocation for gene therapy assets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene delivery platforms for clinical advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in MSC culture, nanovesicle engineering, and AAV vector handling.
- Needs access to extrusion instrumentation and analytical tools for vesicle characterization.
- Demands cross-team standardization for reproducible vesicle production and gene delivery assays.
- Adaptation may be needed for different gene payloads or disease models.
- Production scalability and vesicle characterization must be validated for each application.