Fare Adrenal Korteksinden Bölge Zenginleştirilmiş Birincil Kültürlerin Oluşumu

Araştırmam, zona glomerulosa ve zona fasciculata farklılaşmasında ACM ve Wnt sinyalizasyonu ile tümör gelişimine odaklanarak adrenal mikroçevre düzenlemesini inceledi. Mevcut yöntemler adrenal bölgeleri net bir şekilde ayırt edemez. Bu protokol, ZG ve ZF'yi zenginleştirerek farklı hücre tiplerinin incelenmesini mümkün kılar.

Bu protokol, ZG ve ZF'de adrenofizyoloji, zonasyon ve hücre farklılaşması dahil olmak üzere çalışmak için uygulanabilir. Bölge zenginleştirilmiş birincil kültür için böbreküstü bezini izole etmek için, yaklaşık altı ila yedi haftalık 10 ila 15 genç yetişkin erkek fare kullanın. Fareyi ötenazi yaptıktan sonra, steril düz bir yüzeye dorsal decubitus pozisyonuna yerleştirin ve hayvan tüylerini %70 alkolle dezenfekte edin.

Makasla karın kamık bölgesinde ilk kesi açın. Kesiyi her iki taraftan göğüs bölgesine doğru yan tarafta uzatarak peritoneumu ortaya çıkarın. Deriyi dikkatlice geri çekin.

Daha sonra karın kaslarını nazikçe geri çekerek boşluğu açığa çıkarın; kan damarlarının hasarını önlemek için adrenal bezlerin net görselleştirilmesini sağlayın. Mikrobiyal kontaminasyonu en aza indirmek için cerrahi aletleri değiştirin. Sol böbreğin medial ve üstünde, retroperitoneumda, oval şekilli ve pembe renkte, beyaz yağ dokusu ile çevrili sol böbrek bezini tespit edin.

Künt forseps kullanarak, bitişik organları dikkatlice yerinden değiştirerek böbreküstü bezinin görselleştirilmesini iyileştirin. Makasla, çevredeki yağ dokusunun çoğunu kısa kontrollü kesiklerle çıkararak böbreküstü bezini izole edin. Kapsülüne zarar vermemek için böbreküstü bezi doğrudan tutmaktan kaçının.

İzole edilmiş böbreküstü bezini, tüm örnekler toplanana kadar 10 mililitre önceden ısıtılmış DMEM F-12 ortamı içeren bir P60 kültür kabına hemen yerleştirin. Sonra, sağ böbreğin yan ve üst kısmında retroperitoneumda bulunan sağ böbrek bezini tespit edin; karaciğere, yükselen kolona ve yakındaki kan damarlarına yakınlığının görselleştirmeyi daha zor hale getirebileceğini belirtin. Yanlışlıkla kesilen ve kanamayı önlemek için böbrek damarlarını ve böbrek arterlerini dikkatlice kontrol edin.

Sağ böbreküstü bezi izole ettikten sonra, sol böbrek üstü beziyle aynı prosedürle her iki bezi aynı kaba yerleştirin. Kültür kabını %70 alkolle temizleyin, sonra bezleri laminar akış başlığına aktarın. Sonra, böbreküstü bezlerini 25 derece Celsius sıcaklığında PBS içeren kaplardan ardışık olarak geçirerek üç kez yıkayın.

Son yıkamadan sonra, ayrılmış dokuları önceden ısıtılmış DMEM içeren dördüncü bir tabakta toplayın ve birden fazla bezin hazırlanması sırasında canlılığı korursunuz. Adrenal bezleri diseksiyon için bir filtre kağıdına aktarın. Sonra, ince forseps kullanarak, adrenal bezi yapışkan yağ dokusuyla kavrayın.

Kapsüle zarar vermemek için filtre kağıdındaki yağı dikkatlice kontrollü hareketlerle disseksiye edin. Bezin pürüzsüz ve sağlam olduğundan ve fazla yağ ile bağ dokusundan arınmış olduğundan emin olun. Adrenal bezleri dikkatlice taze filtre kağıdına aktararak hassas mikro diseksiyon yapılmasını sağlar.

İnce forseps kullanarak, böbreküstü bezinin kapsülünü nazikçe sıkıştırın. Bir bistür bıçağı kullanarak, dokuyu tamamen kesmeden bezde radyal bir kesi yapın. Korteksin iç içeriğini kesi yoluyla dışarı doğru dışarı çıkarmak için hafif mekanik basınç uygulayın.

Kapsül ve zona glomerulosa'yı forsepsin ucuna bağlı tutarken iç bez materyalini açığa çıkarın. Dışarı atılan iç bez materyalini zona fasciculata ve medulla olarak tanımlayın. Tüm bezler işlendikten sonra enzimatik sindirimi başlatmak gerekir; böylece dış ve iç bölgelerin doğru mekanik ayrılması sağlanır.

Santrifüjasyondan sonra, toplanan hücreler kültür ortamında yeniden askıya alın. Adrenal hücre kültürü kurulduktan sonra, kültürlenen hücrelerin moleküler karakterizasyonunu gen ekspresyonu analizi ve immünboyama ile gerçekleştirin. Primer adrenal hücre kültürleri, zonaglomerulosis hücreleri için zenginleştirilmiş dış fraksiyon ve zona fasciculata hücreleri için zenginleştirilen iç fraksiyondan başarıyla oluşturulmuştur.

Soy izleme fare modeli, Cyp11b2 promotoru tarafından yönlendirilen zona glomerulosa-spesifik mGFP ifadesinin görselleştirilmesini sağladı. mGFP ekspresyonu ağırlıklı olarak zonaglomerulosa ile zenginleştirilmiş kültürlerde gözlemlenmişken, zona fasciculata ile zenginleştirilmiş kültürler öncelikle mTomato eksprese edilmiştir. Cyp11b2, Dab2 ve Sonic kirpi kültürlerinde dış fraksiyon kültürlerinde iç fraksiyon kültürlerine kıyasla daha yüksek göreli ifade seviyeleri gözlemlenmiştir.

İç fraksiyon kültürleri, dış fraksiyon kültürlerine kıyasla Cyp11b1 ve Akr1b7'nin göreceli ekspresyonunu daha yüksek göstermiştir. Aldosteron salgısı, zonaglomerulosa ile zenginleştirilmiş kültürlerde zona fasciculata ile zenginleştirilmiş kültürlere göre daha yüksekti. Dış fraksiyon kültürlerinde, anjiyotensin II, potasyum ve adrenokortikotropik hormon ile uyarılma sırasında aldosteron salgısı daha da artmıştır.

Kortikosteron salgısı, zona fasciculata ile zenginleştirilmiş kültürlerde zona glomerulosa zenginleştirilmiş kültürlere kıyasla daha yüksekti. Zona fasciculata ile zenginleştirilmiş kültürlerde, adrenokortikotropik hormon ve forskolin uyarısına yanıt olarak kortikosteron salgılanmasının arttığını gösterdi. Bu protokol, hormon üretimi, sinyal yolu ve hücre dışı matriks dahil olmak üzere bölgeye özgü fizyoloji ve farklılaşmanın incelenmesini sağlar.

Gelecekteki çalışmalar, adrenal zonlaşma ve farklılaşma mekanizmalarını inceleyebilir ve bu hücrelerin 3D model oluşturarak ECM etkileşimlerini incelemesini sağlayabilir.