Tek Hücre Elektroporasyon bozulmamış Gelişmekte olan beyin içindeki in vivo

Tek hücreli elektroporasyon, gelişmiş in vivo görüntüleme teknikleriyle birleştirildiğinde in vivo preparatlar da dahil olmak üzere, bozulmamış bir doku içindeki tekil hücrelere DNA veya diğer makromoleküllerin iletilmesine olanak tanıyan özelleşmiş bir tekniktir. Florasan işaretleyicilerin tek hücreli elektroporasyonu; hücresel morfolojinin, hücre büyümesinin ve hücreler arası olayların saniyelerden günlere kadar uzanan zaman dilimleri boyunca doğrudan görselleştirilmesine imkan tanır. Bu videoda, XUS iribaşının bozulmamış beynindeki nöronlara florasan bir boyanın veya plazmid DNA'nın tek hücreli elektroporasyon prosedürünü detaylandırdık ve florasanla işaretlenmiş nöronların canlı görüntüleme örneklerini gösterdik.

Merhaba. Benim adım Eth Haa; British Columbia Üniversitesi Beyin Araştırma Merkezi'nde Dr. Kurt Haass'ın laboratuvarında çalışıyorum. Bugün, albino XUS Lavis iribaşının sağlam beyni içerisindeki nöronların hedeflenmiş tek hücre elektroporasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini göstereceğim.

Bu tekniğin belirgin avantajı, çevre dokuyu değiştirmediği halde tekil hücreler üzerinde deneysel manipülasyonların gerçekleştirilebilmesi ve böylece hücre otonom etkilerin global uygulamalardan kaynaklanan etkilerden ayırt edilebilmesidir. İlk adım, uygun uç çapına ve koniklik açısına sahip mikropipetlerin hazırlanmasını ve ardından transfer materyalinin mikropipete doldurulmasını içerir. Daha sonra TA havuzları anestezi altına alınarak fiksasyon odasına aktarılmalı, ardından mikropipet beyne yerleştirilmeli ve bir dizi voltaj darbesi uygulanmalıdır.

Son olarak, etiketlenen nöronlar iki foton mikroskopisi kullanılarak görüntülenir. Bu tekniği size iribaşlar üzerinde gösterecekler. Tek hücre etiketlemesi, ex vivo preparasyonların yanı sıra diğer model sistemlerde de kullanılabilir.

Bunu göz önünde bulundurarak başlayalım. Tek hücreli elektroporasyon, elektrik alanını pipet ucuyla temas halindeki tek bir hücreyle sınırlayan, çekilmiş cam mikro pipet elektrot kullanımıyla tek bir hücreyi hedefler. Pipet ucunun fiziksel geometrisi, tekniğin başarısını doğrudan etkileyen kritik bir özelliktir.

Dış çapı 1,5 mm ve iç çapı 0,75 mm olan, uç kısmının hava kabarcığı oluşmadan doldurulmasını kolaylaştırmak için dahili bir filaman içeren borosilikat camdan mikro pipetler üretmek amacıyla P 97 model bir ısıtıcı çekici kullanılır. Tek hücreli elektroporasyon için en etkili olduğu belirlenen pipet uçları, 0,5 ile 1 µm arası uç çapına ve 10 dereceden büyük koniklik açılarına sahip olanlardır. Cam mikro pipet çekildikten sonra, çözelti içindeki transfer materyali, geri doldurma yöntemiyle veya bir yükleme şırıngası kullanılarak pipete yüklenebilir.

Bu gösterimde, tekil nöronları burada görülen floresan bir boya veya GFP (yeşil floresan protein) kodlayan bir plazmit ile floresan olarak işaretleyeceğiz. Pipete giren partikül kalıntılarının miktarını azaltmak için GFP yeşil floresan protein çözeltileri yüksek hızda kısa süreli santrifüj edilmelidir. Bu durum yeni kullanıcılar için uç tıkanma olasılığını artıracağından, epi-floresan altında kolayca görülebildikleri için floresan boyalarla başlanması tavsiye edilir.

Bu, ucun örnek içindeki görünürlüğünü sağlar ve ekipmanın uygun şekilde kurulup kurulmadığı ile pipet ucunun uygun olup olmadığı konusunda doğrudan geri bildirim verir. Güzel. Mikropipeti hazırladığımıza göre, tek hücre elektroporasyonu prosedürünün uygulanmasına geçebiliriz.

Bu teknik için gerekli elektrikli ekipmanlar; bir stimülatör, bir osiloskop ve pipete yerleştirilecek gümüş bir telle donatılmış pipet tutucudur. Burada Axon Instruments marka Ax Separator 800 A kullanmaktayız, ancak Grass SD 9 gibi yaygın stimülatörler de kullanılabilir. Ax Separator, Ax Separator ile gümüş tel elektrot arasında arayüz görevi gören kafa aşamasına (head stage) bağlanır.

İribaş dış toprağı, iribaş ile elektronik teması sürdüren basit bir gümüş teldir. Elektroporasyon sırasında, kafa katı, toprak kablosu ve iribaş dış toprağının her ikisi de osiloskop girişine bağlanır. Elektrikli ekipmanlar kurulduktan sonra, pipet pipet tutucuya yerleştirilebilir.

Pipet tutucu, hassas hareket imkanı sağlayan üç eksenli bir mikro manipülatöre monte edilmelidir. Tek hücre elektroporasyonu, iyi bir çalışma mesafesine sahip bir mikroskop gerektirir. Bu durum, manevra için daha fazla alan sağlar ve pipetin yaklaşık 30 ila 45 derecelik bir açıyla getirilmesine olanak tanır.

Ekipman uygun şekilde bağlandıktan sonra, tek hücreli elektroporasyon prosedürüne başlayabiliriz. İlk olarak iribaşlar, %0,02 MS 2 içinde daldırılarak anestezi uygulanır; genellikle iribaşlar tamamen anestezi altındadır. Yaklaşık beş dakika sonra, tek bir iribaş elektroporasyon haznesine aktarılır.

Plastik bir transfer pipeti kullanılarak, küçük bir silikon blokta iribaş şeklinde bir boşluk oyulup, iribaş odağa yerleştirildiğinde derisiyle temas edecek şekilde gümüş bir topraklama teli yerleştirilerek oda kolayca kurum içinde hazırlanabilir. Ardından, iribaşı konumlandırmak için bir boya fırçası kullanmak, dorsal tarafın yukarıya bakmasını sağlayacaktır. Daha sonra mikro pipet, ilgi bölgesinin hemen bitişiğindeki deriyle temas edene kadar aşağı indirilir.

Pipetin indirilmeye devam edilmesi başlangıçta deride bir çukurluk oluşturacak ve ardından alttaki dokuya geçecektir. Burada, tadpole beyninin optik lobunu hedefliyorum. Özellikle hücre gövdesi tabakası bölgesini amaçlıyorum.

Eğer bir xi kullanıyorsanız, pipetin dokudaki direnci izlenebilir. Genellikle direnç 10 ile yaklaşık 40 arasındadır. Mega ohm değerleri uygun sonuçlar verir.

Pipet direnci, uç çapının çok küçük olup olmadığının veya ucun tıkanıp tıkanmadığının iyi bir göstergesidir; bu durumlarda direnç yüksek olacaktır. Öte yandan, uç çapı çok genişse veya uç kırıksa, pipet direnci düşük olacaktır. Konvansiyonel bir stimülatör kullanılırken mutlak direnç, yani pipet direnci ölçülemez.

Osiloskop okuması, floresan dekstran boyaları için pipet direncinin dolaylı bir ölçümüdür. Stimülasyon, 300 hertz frekansında uygulanan 10 milisaniyelik pozitif kare dalga darbelerinden oluşan bir diziden ibarettir. Münferit darbeler 300 mikrosaniye sürelidir ve 50 voltluk bir gerilimle uygulanır.

Bu ayarlar kullanıldığında, elektroprob işleminden sonra bir stimülasyon uygulandığında görüldüğü üzere, floresan boya uçtan dışarı atılır. Pipet bir bölgeden geri çekilir ve verimi artırmak için işlem doku içindeki farklı bölgelerde tekrarlanır. Bir voltaj pulse dizisi iletilirken, osiloskop üzerinden ortaya çıkan pulse'ların genliği izlenmeli ve gerekirse genlik 1 ile 1.5 µA arasına ayarlanmalıdır.

Voltaj önemli ölçüde artırıldıktan sonra puls genliği düşük kalmaya devam ederse veya prosedür sırasında düşerse, bu durum ucun tıkalı olduğunu veya uç çapının çok küçük olduğunu kuvvetle göstermektedir. Bu durum gerçekleştiğinde oldukça can sıkıcı olabilir. Öte yandan, uygulanan voltaj önemli ölçüde azaltıldıktan sonra genlik hala yüksekse veya prosedür sırasında yükselirse, bu durum ucun ya çok geniş olduğunu ya da kırıldığını veya uçların kırıldığını kuvvetle göstermektedir.

Sık sık çok duygulanıyor ve üzülüyorum. Daha önce belirtildiği gibi, floresan boyaların kullanılmasının avantajı, verilen stimülasyon parametrelerini kullanarak tekil hücrelerin elektropore edilip edilmediğinin anında kontrol edilebilmesidir. Hücreler çok sönük görünüyorsa veya hiçbir hücre işaretlenmemişse, işaretlenmiş hücreler şu şekilde parlak görünene kadar her bir stimülasyon parametresi bağımsız olarak kademeli olarak artırılarak başlanır; düzgün şekilde işaretlenmiş hücreleri görmek günümü güzelleştiriyor.

Öte yandan, çok sayıda hücre etiketlenmiş görünüyorsa, tek bir hücrenin bunun gibi parlak bir şekilde etiketlendiği görülene kadar stimülasyon parametreleri kademeli olarak düşürülür. Parlak şekilde etiketlenmiş hücreleri görmek gerçekten tatmin edicidir. Plazmit DNA durumunda, kullanılan puls trenleri 300 hertz frekansında iletilen bir milisaniye süreli negatif pulslardır ve tren süresi 500 milisaniyedir.

Elektroporasyondan sonra, TA larvaları anesteziden hızla kurtuldukları taze yetiştirme çözeltisine yerleştirilir. Genellikle, 50 ila yüz TA larvasına elektroporasyon uygulandıktan sonra, bir sonraki aşamada size göstereceğim tarama işlemine geçebiliriz. Görüntüleme deneylerine başlamadan önce, elektropore edilmiş larvaları dik bir epi-floresan mikroskop kullanarak hızlıca taramak faydalıdır.

Görüntüleme için uygun nöronlara sahip olan iribaşların belirlenmesi amacıyla, iribaşlar anestezi altına alınır, ardından bir puro haznesine yerleştirilir ve üzerleri lamelle kapatılır. Ardından, tekil floresan işaretli nöronların mevcut olup olmadığını belirlemek için münferit iribaş beyinleri epi-floresan ışık altında hızla incelenir. Epi-floresan ışığa aşırı maruz kalmanın, işaretli hücreyi öldürebilecek fototoksisiteye yol açacağını unutmayın. Bu nedenle, hücrelerin floresan ışığa maruz kaldığı süreyi en aza indirmeye çalışın.

Dekstran boyalar söz konusu olduğunda, tarama elektroporasyondan 30 dakika sonra başlayabilir. Ancak, daha uzun aralıkların daha düşük arka plan floresan seviyeleri ile ilişkili olduğunu gözlemlemekteyiz. Plazmid durumunda, DNA taraması tipik olarak elektroporasyondan en az 12 saat sonra yapılır.

Tadpole optik tektumundaki nöronları floresanla işaretlemek için rutin olarak tek hücreli elektroporasyon kullanıyoruz. İki fotonlu mikroskobumuz, bir Olympus FV 300 konfokal mikroskop ve bir Chameleon XP lazer ışık kaynağı kullanılarak özel olarak inşa edilmiştir. Yeşil floresan görüntüleme için tipik olarak 910 nanometre dalga boyu kullanıyoruz.

Tek bir işaretlenmiş AL nöronuna sahip bir iribaş bulup onu iki foton düzeneğimize yerleştirdikten sonra, farklı zaman aralıklarında dokunma nöronlarının zaman aşımı foton görüntülemesini gerçekleştirmeye geçeriz. Bu, AL hücrelerinin dendritik dallanmalarının dinamik büyüme modellerini gözlemlememize olanak tanır. Burada, tek hücreli elektroporasyon kullanılarak işaretlenmiş GFP eksprese eden bir nöron örneği görüyoruz.

Bu görüntü, nöronal büyümeyi nicelleştirmek amacıyla in vivo iki foton mikroskopisi kullanılarak elde edilmiştir. Genellikle her nöronal görüntünün iskeletleştirilmiş üç boyutlu rekonstrüksiyonları oluşturulur. Uzatılmış aralıklarla yapılan zaman ayarlı görüntüleme, deneysel bir manipülasyonun uzun vadeli sonuçları hakkında bilgi sağlar.

Burada, dendritik ağacın gelişimi boyunca dört gün boyunca her gün görüntülenmiş, GFP eksprese eden olgunlaşmamış bir nöron görüyoruz. Bu görüntüler iki foton mikroskobu kullanılarak yakalanmış olup Z projeksiyonları olarak sunulmuştur. Hızlı zaman ayarlı görüntüleme, dendritik filopodyumların oluşumu ve geri çekilmesi dahil olmak üzere nöronal büyümenin daha dinamik süreçlerinin doğasını gözlemlememize olanak tanır.

Bu video, bir saat boyunca her iki dakikada bir üç boyutlu olarak görüntülenen, nispeten olgun bir GFP eksprese eden nöronu göstermektedir. Bu, bir saat boyunca her beş dakikada bir görüntülenen, olgunlaşmamış bir GFP eksprese eden nörona örnektir. Daha genç nöronlar, kapsamlı dal büyümesi ve dal geri çekilmesi sergileyerek oldukça dinamik bir yapıdadırlar.

GFP eksprese eden bu nöronun yakınlaştırılmış görünümü, bu sistemdeki gelişmekte olan nöronlar için tipik olan dendritik filopodyumların sürekli eklenmesini ve geri çekilmesini göstermektedir. Albino iribaşın şeffaflığı ve beyninin erişilebilirliği, bu model sistemi canlı bir organizma içindeki nöronal büyümeyi ve hücre içi olayları görselleştirmek için ideal kılar. Tek hücreli elektroporasyon, tek bir nöronun büyümesini görselleştirmemize ve aksi takdirde değiştirilmemiş bir beyin içinde hücreye özgü manipülasyonlar gerçekleştirmemize olanak tanır.

Böylece size zap lavis tat pollerinde tek hücreli elektroporasyonun nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk, ancak burada TA pollerinde elektroporasyona odaklandık. Bu teknik diğer organizmalarda da kullanılmıştır; ayrıca hipokampal kesitlerde ve disosiye hücre kültürlerinde de uygulanmıştır. Bu prosedürü gerçekleştirirken, yüksek verimi korumak için pipet uçlarınızı ve stimülasyon parametrelerinizi sürekli olarak modifiye ettiğinizden emin olmanız önemlidir.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.