Schmidtea Akdeniz'de Candida albicans enfeksiyonu için Mantar Patogenezi ve Konak Savunmasını Araştırmak İçin Optimize Edilmiş Bir Protokol

Araştırmalarım, Candida albicans enfeksiyonlarına ve konak yanıtlarının sonucun temizlenme mi yoksa hastalık ilerlemesi mi olup olmadığını nasıl şekillendirdiğine odaklanıyor. Temel zorluklardan biri, erken mantar enfeksiyonu için modellerin eksikliğidir. Bu protokol, planari yöntemi yönetilebilir, yüksek verimliliğe sahip bir çözüm olarak kullanır.

Planari sistem, hastalık başlangıcı, ilerlemesi, temizlenmesi ve ölümcüllüğünün incelenmesini sağlar ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarının yüksek çözünürlüklü ölçümü sağlar. Başlamak için, yaklaşık beş milimetre uzunluğunda Schmidtea akdeniz planaryalarını stereomikroskop altında seçin ve hayvanların ölçülmeden önce tamamen uzatıldığından emin olun. Beş milimetreden küçük planarik bitkiler kullanmaktan kaçının; çünkü bunlar blasteması veya eksik gelişimi olan bireyleri içerebilir ve tutarsız sonuçlar verebilir.

Ayrıca, beş milimetreden büyük planari hayvanları hariç tutun, çünkü daha büyük hayvanlar floresans immünboyama için daha az uygundur. Blastema, pigmentasyon eksikliği olan doku veya eksik pigmentasyon gelişimi olan hayvanları hariç tutun. Tüm dahil etme kriterlerini karşılayan sağlıklı planari, doku kültürü olmayan altı delikli polistiren plakada her kuyu başına iki mililitre taze planarial suya aktarın.

Negatif kontroller için enfekte olmamış veya sahte tedavi edilmiş hayvanlar ve vahşi tip Candida albicans ile enfekte hayvanlardan oluşan pozitif kontrol kuyuları atayın. Her kuyudaki tüm suyu çıkarın ve yerine iki mililitre taze planari su ekleyin, böylece kuyular arasında eşitlik sağlanır. Hayvanların enfeksiyondan önce bir gün boyunca yeni ortamda denge kurmasına izin verin.

Altı kuyu levhayı eğin ve aseptik teknikle bir kuyudaki tüm suyu nazikçe tek tek çıkarın. Hemen bir sonraki kuyuya geçmeden önce hesaplanan planari su ve Candida albicans kültürünü kuyuya ekleyin. Aşı tarihini ve saatini kaydedin.

Aşılanmış altı kuyu plakayı oda sıcaklığında karanlık, statik bir yere yerleştirin. Planari, istenen son noktaya bağlı olarak Candida albicans ile 72 saate kadar kuluçka yapın. İlk zaman noktasında, enfeksiyondan 24 saat sonra, plakayı hafifçe eğin.

Daha sonra, steril bir transfer pipeti kullanarak, Candida albicans kültürünü içeren sıvıyı aspire eder ve hayvansız bir bölgeye nazikçe dağıtarak yerleşmiş mantar tabakasını karıştırır. Bu adımı her kuyu başına beş ila on kez tekrarlayın, yerleşmiş mantar tabakasını parçalamak için planarilerle doğrudan temas kurmaktan kaçının. En iyi görünürlük için yeniden asma adımlarından önce ve sonra karanlık bir arka planda mantar yerleşimini gözlemleyin.

Enfekte olmamış kontrol kuyularını aynı koşullarda yeniden askıya alın. Bu prosedürü enfeksiyondan 48 saat sonra tekrarlayın. Enfeksiyondan 72 saat sonra, planarları iki mililitre temiz su ile taze kuyulara aktarın; böylece mantar bulaşma minimum sıvı kullanılarak en aza indirilir.

Hayvanlar nakledildikten sonra tüm suyu çıkarın ve yerine taze planari su verin. Enfeksiyondan bir gün sonra konak sonuçlarını değerlendirmeye başlayın ve istenen deneysel son noktaya kadar günlük olarak devam edin. Standart sıfırdan üçe puanlama sistemiyle konakçı hasarını nicelikle ölçemek.

Enfeksiyondan üç gün sonra, planari kuyuda iki mililitre taze planari su içeren yeni altı kuyu talı bir plakaya nazikçe aktarın; kalıntı mantar kültürünün transferinden kaçının. Hayvanları en az 10 kat objektif ile ışık mikroskobu ile gözlemleyin. Standart puanlama tablosu kullanarak host sonuçlarını kaydedin.

Ayrıca, enfeksiyon ve temizleme sırasında konak epitelinin mantar kolonizasyonunu gözlemlemek için anti-Candida immünboyama işlemi yapılabilir. Mantar epitelyal kolonizasyonu, enfeksiyondan dört gün sonra belirgin şekilde azaldı ve enfeksiyondan yedi gün sonra neredeyse tüm yüzeyle ilişkili mantarlar ID50 koşullarında temizlendi. Enfekte olmayan kontroller tamamen semptomsuz kaldı.

Mililitrede yaklaşık 7,0 katı 10 verilmiş yedi Candida albicans hücresi oranında, yaklaşık %30'u semptomatik, %50'si semptomatikti ve %20'si ölüydü. Yaklaşık 8,0 katı 10 mililitrede yedi Candida albicans hücresinin gücünde, yaklaşık %30'u semptomatik, %20'si semptomatikti ve %50'si ölüydü. Medyan hayatta kalma yaklaşık %90'dan 7,0 kat 10'a kadar 7,0 katı 10'dan mililitrede yedi Candida albicans hücresinin gücüne kadar %50'ye, mililitrede yedi hücrenin gücüne göre yaklaşık %50'ye ve mililitrede yedi hücrenin gücüne göre %25'in altına düştü; 8,5 kat 10 ile %25'in altına düştü.

Genel hayatta kalma oranı, yabani tip Candida albicans ile enfekte olan planarianlarda yaklaşık %50 idi; bu oranda mililitrede yedi hücre gücünde yaklaşık 8,0 kat 10 oranında, enfekte olmayan kontrollerde ise %100 sağlıktı. Bu protokol, genetik olarak yönetilebilir bir konakta görüntüleme ve moleküler yaklaşımları entegre ederek konak-patojen dinamiklerinin in vivo incelenmesini sağlar. Gelecekteki uygulamalar arasında yüksek verimli mutant tarama, mikrobiyal türler arasında karşılaştırmalı çalışmalar ve toksikoloji ile ilaç etkinliği testlerine uyum yer almaktadır.