Tıbbi Bitkilerde Tropan Alkaloidlerin Nicelenmesi İçin Verimli ve Hızlı Bir HPLC-QQQ-MS yöntemi

Anisodus tanguticus'ta üç ana tropan alkaloidini hızlıca niceliklendirmek için HPLC-QQQ-MS yöntemi geliştirdik. Geleneksel HPLC, tropan alkaloidlere karşı duyarlılıktan yoksundur. Bu yöntem, bu problemi çözmek için son derece hassas kütle spektrometrisi kullanır.

Başlamak için, doğru şekilde 10,0 miligram hyoscyamin, anizodamin hidrobromid ve skopolamin hidrobromid referans standartlarını tartın. Onları ayrı bir 10 mililitrelik hacimsel şişeye yerleştirin. Her hacimsel şişedeki işaretli çizgiye kromatografik derecede metanol ekleyin.

Standartları ultrasonik işlemle iyice çözerek mililitrede 1,0 miligram konsantrasyona sahip tek standart stok çözeltileri hazırlanır. Sonra, stok çözeltilerini kahverengi reaktif şişelerine aktarın ve dört derece Celsius sıcaklığında karanlıkta saklayın. Mililitrede 10 mikrogramlık karışık standart ara çözelti hazırlamak için, önceden hazırlanmış her stok çözeltisinden 100 mikrolitre pipetle 10 mililitrelik hacimsel bir şişeye pipetleyin.

Sonra, işaretlenmiş çizgiye kromatografik derecede metanol ekleyerek çözeltiyi seyreltirin. Sonrasında, taze Sophora flavescens malzemesini dondurarak kurutma işlemi yapın. Sonra, yüksek hızlı bir öğütücüyle, kurutulmuş malzemeyi homojen bir toz haline getirerek ezer.

Tozu 0,25 milimetrelik standart test elek ile geçirin. Elek tozunun 20 miligramını doğru şekilde tartın. Onu 100 mililitrelik hacimsel bir şişeye aktarın ve işaretlenmiş çizginin hemen altına kromatografik kalitede metanol ekleyin.

Sonrasında, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ultrasonik ekstraksiyon yapılacaktır. Sonra, hacimsel termosunu çıkarın ve oda sıcaklığında 25 derece Celsius'a kadar soğumasına izin verin. 100 mililitre işaretli çizgiye kromatografik derecede metanol ekleyin ve girdabı iki dakika karıştırın.

Sonra, hazırlanan ekstrakttan bir mililitreyi 100 mililitrelik hacimli bir şişeye pipetleyin. İşareli çizgiye metanol ekleyin. İyice karıştırın ve HPLC enjeksiyonu için ana çözeltiyi elde edin.

Örnek filtreleme için, bir mililitrelik tek kullanımlık iğnesiz bir şırınga ve 0,22 mikrometrelik organik faz mikrogözenekli bir membran hazırlayın. Enjekte edilmek üzere 1,2 mililitre ana çözeltiyi şırıngaya aspire edin ve çözeltiyi zardan yavaşça iterek filtreleyin. Filtratı iç iç bir iç iç ile iki mililitrelik örnek şişesine topla ve şişeyi bir kapakla sıkıca kapat.

Mobil faz A'yı 1000 mililitre ultra saf su ölçüyerek hazırlayın. 1,0 mililitre kromatografik kalitede formik asit ekleyin ve manyetik karıştırıcı ile 10 dakika boyunca eşit şekilde karıştırın. Sonra, ek işlem olmadan doğrudan kromatografik derecede metanol kullanarak mobil faz B hazırlanır.

Degas mobil faz A ve B'yi 40 kilohertz'de 15 dakika boyunca ayrı ultrasonik gazlama üniteleriyle uygular. Ayrı çözücü şişelerdeki gazdan gazlanmış mobil fazları HPLC sisteminin ilgili A ve B hatlarına bağlayın. Kromatografik ayırım için bir C18 kolonu kullanın.

Kolon, dakikada 0,3 mililitre akış hızında 30 dakika boyunca 80'e 20 oranında metanol ve su ile dengeleyin. Sütun fırın sıcaklığını 30 derece Celsius olarak ayarlayın ve önceden 10 dakika önceden ısıtın. Sonra, akış hızını dakikada 0,60 mililitre, enjeksiyon hacmini iki mikrolitre ve tespit dalga boyunu 210 nanometreye ayarlayın.

Bundan sonra, sunulan koşullarla gradyan elütasyon programını ayarlayın. Pozitif iyonizasyon modunda çalışan elektrosprey iyonizasyon kaynağına sahip üçlü bir quadrupol kütle spektrometresi kullanılarak kütle spektrometrik tespiti gerçekleştirin. Nebulizatör basıncını 15 pound/inç kare, kapiler voltajı 4.000 volt, gaz sıcaklığını 300 derece Celsius ve gaz akışını dakikada 11 litre ayarlayın.

Sonra, birden fazla reaksiyon izleme iyon çifti için parametreleri ayarlayın. Öncü iyonları tespit etmek için, MS2 tarama modunda bireysel standart çözeltileri doğrudan infüze edin. Yöntem doğrulamasından sonra, çoklu reaksiyon izleme modunda veri toplama işlemi yapılın.

Burada sunulan her analiz için öncü iyyon, ürün iyon geçişleri, fragmentor voltajı ve çarpışma enerjisi gibi optimize edilmiş parametreleri kullanın. Nitel analiz yazılımını başlatın. Dosyayı seçin ve toplanan tüm veri dosyalarını içe aktarmak için verileri içe aktarın.

Her çıkarılmış iyon kromatomografisinde hedef zirvelerin zirve simetrisini ve tutma süresi tutarlılığını kontrol edin. Nicel modülünde MRM geçişini seçin. Her bileşen için öncü iyon ve ürün iyon çiftlerini girin ve ilgili çıkarılmış iyon kromatogramlarını çıkarın.

Nicel analiz için zirve alanını hesaplayın. Üç hedef tropan alkaloidi de optimize edilmiş HPLC koşullarında 20 dakika içinde başarıyla ayrıldı. Skopolamin ile anizodamin arasındaki çözünürlük 8.67 idi.

Anisodamin ile hiosyamin arasındaki bu 11.58'e ulaşırken, tüm çözünürlük değerleri 1.5 temel ayırma kriterini önemli ölçüde aştı. Tüm analitler, 0,014 ila 0,320 mikrogram/mililitre konsantrasyon aralığında iyi doğrusal bir performans gösterdi ve korelasyon katsayıları 0,99'dan büyüktü. Ortalama iyileşme oranları skopolamin için %101,44, anizodamin için %100,25 ve hiosyamin için %99,56 olup, göreceli standart sapmalar sırasıyla %1,85, %2,35 ve %1,9 olmuştur.

10 Anisodus tanguticus örneğinde üç tropan alkaloidinin nicelendirilmesi, skopolamin içeriğinin altıncı örnekte gram başına 0,3667 miligramdan yedinci numunede grama 1,0356 miligrama kadar değiştiğini gösterdi. Anizodamin içeriği, 6. numunede gram başına 0,0269 miligramdan 10 numaralı örnekte gram başına 0,3590 miligrama kadar değişiyordu. Hyoscyamin içeriği ikinci örnekte gram başına 0,2930 miligramdan 10 numaralı numunede gram başına 1,4989 miligrama kadar değişirken, dördüncü, yedi, dokuz ve 10 numaralı örneklerde daha yüksek seviyeler gözlemlenmiştir.

Bu protokol, üç ana tropan alkaloidinin hızlı ve doğru nicelendirilmesini sağlar. Temel zorluk, doğru ölçüm için cihaz prosedürü ve standart örnek hazırlığını sağlamaktır. Bu yöntem, Anisodus tanguticus'taki diğer metabolitleri keşfetmek ve niceliklendirmek için genişletilebilir.